解讀單細胞RNAseq技術

　　多年來，跟蹤一個單細胞的轉錄組，超出了我們的能力。但是現在，時代已經變了，新的單細胞RNA-seq方法，可以分析大量的細胞及它們的命運。

　　我們都參加過大型生日派對：在擁擠的房間里，與許多人聊天、吃飯和慶祝。但是，試想你并不知道壽星是誰，只是像一個局外者看待這個派對。你可能會覺得整個事件看起來與其他的生日派對沒有什么不同。然而，派對上的每個人都在壽星的生活故事里擔當獨特的角色。所以，如果不知道每位來賓和他們的角色，一個局外人可能就會做出錯誤的假設，或錯認聚會上的人。

　　復雜器官的細胞成分，有點類似于生日派對。細胞群體在特定的時刻聚在一起，執行關鍵的功能，形成一種器官。細胞亞群以不同的方式起作用，在特定的時間點履行專門的職責。（如同在聚會上，不同的人帶來禮物、吃食或幫助安排活動）。從技術的角度來看，仔細分析這些細胞如何單獨起作用，制造一個器官，為研究人員帶來了巨大的挑戰。但是，隨著科學家們不斷設計出的巧妙新技術，梳理每個細胞在許多復雜過程中所起的作用，這些挑戰都會逐漸消失。

　　一系列事件

　　當進入一個生日聚會時，大多數人所做的第一件事情就是，簡單的觀察，跟來賓交談。他們是誰？他們做什么？他們來自哪里？他們認識壽星多久了？

　　在解決“單個細胞如何在復雜系統中起作用”的過程中，科學家采取了相似的路徑。他們選擇單個細胞并孤立地研究它們。然而，分離單個細胞進行分子分析，非常棘手，而接下來的問題是，一旦分離出它們之后，如何研究它們？那就是，測定特定時刻每個細胞正在制造的RNA轉錄本，對正在發生的事情獲得一個快照。有了足夠多的快照，就有可能漸漸弄清復雜的細胞事件和不同生物學過程所需的時間。

　　單細胞RNA測序（RNA-seq），是從2008年高通量測序變革陰影中出現的新一代測序（NGS）應用，當時有幾個實驗室報道了測定生物學樣本RNA含量的不同方法。在過去的六年中，RNA-seq已經給我們展示了RNA世界的驚人多樣性，從我們已經知道的轉錄合成蛋白質的mRNA，到在細胞中發揮調節作用的非編碼RNA。相關閱讀：利用RNA-seq研究非模式生物。

　　早期的RNA-seq研究主要集中在細胞群體，在細胞周期不同時間點的細胞混合物，對其進行測序，以確定正在表達的RNA轉錄本。而這些轉錄譜能提供已知的和新的RNA目錄，這一信息可告訴你參加聚會的賓客名單。這是一個很好的開始，但沒有提供你可能會喜歡的詳盡細節。

　　時間就是一切

　　哈佛大學醫學院的再生生物學和干細胞助理教授John Rinn，致力于探索RNA世界。他已經發現了一些新的功能性非編碼RNA（ncRNA），ncRNA一度被認為是跟轉錄噪聲差不多的分子。

　　長非編碼RNA（LncRNA，例如XIST）是一類專門的RNA，其生物學作用最近才開始為人所了解。Rinn稱：“我們可以利用單細胞測序，進一步了解XIST的功能。”

　　在2012年，Rinn的研究小組開始尋找更多功能形式的長非編碼RNA，特別尋找充當強大細胞調控因子的RNA。為此，他和同事們應用單細胞RNA-seq，來檢測細胞分化這類過程中基因轉錄的pseudotemporal動力學。通過編目所有的細胞RNA，連同它們在細胞中的出現和消失時間，Rinn希望找到一些有趣的新lncRNA，他能夠將特定的功能歸因于這些新lncRNA。但是，很奇怪的事情發生了：他發現了無聊的舊mRNA。

　　Rinn將這些結果發表在今年3月份的《Nature Biotechnology》雜志，介紹了肌細胞生成的6種新細胞調控因子，他解釋說：“細胞沒有定義明確的mRNA表達模式，它不像‘現在打開’和‘關閉’那么簡單。”然而，對Rinn來說最大的驚喜可能就是，他在數據中觀察到了基因表達的隨機性，相當于在生日聚會上不斷來去的人們，每一分鐘都在改變著房間的動態。你如何捕捉所有這些變化并分析這些數據呢？

　　隨機性總是為生物學家帶來挑戰。在這種情況下，在單個細胞之間基因表達數據顯示出非常高程度的可變性。生物學變化不是唯一的問題——Rinn也需要考慮測序文庫制備過程中的實驗可變性。但是可變性也提出了可能性。

　　Rinn指出：“實際上，可變性和多樣性會告訴你調控因子在哪里。”想象一個調控因子不受可變性的影響——這會產生更多的數據可信性。他們的解決方案是，開發一種無人監督的聚類算法，稱為Monocle，能夠提高單細胞RNA-seq數據的時間分辨率，并處理基因表達數據中的變化。利用Monocle的分類方法，Rinn能夠找到六種新的肌細胞生成調控因子，同時解釋數據集中的實驗和生物學變化。

　　諸如Monocle的程序的出現，最終會為研究人員提供一種途徑，以一種有意義的方式，檢測生物學過程的基因表達動力學，使他們能理解來自RNA-seq轉錄本目錄的所有數據，較全面地了解細胞動力學。

　　準備一個大型聚會

　　當研究很少數的細胞時，用今天的測序技術和分析平臺，去確定在轉錄級聯早期或晚期階段中正在打開的是什么，是一個相當簡單的實驗。但是，怎樣處理較大數量的細胞，獲得更詳細的信息呢？

　　通過在小型生日聚會上與別人交談，可以了解更多關于壽星的事情。然而，這不難看出，隨著聚會越來越大，很難發現那些相同的模式、趨勢和信息。如果你只跟一小部分的客人交談，如果偶然他們告訴我們關于壽星的完全不同的故事、給我們的信息太少，以至于不能建立聯系并得出結論，會發生什么情況？顯而易見的答案是，我們需要跟更多的人交談。在單細胞分析中同樣如此。

　　Rinn說：“用200個細胞，你開始了解情況。但是原則上，你采用的細胞越多，分辨率就越高。”分析幾百個單細胞全轉錄組的實驗，即使用今天的測序系統，工作量也很大，這還不考慮數據分析在內。

　　魏茨曼研究所免疫系的Ido Amit面臨著這種情況。測定有限數量細胞的轉錄組，特別是那些已經用特殊細胞標記分離出來的細胞，因此，這對復雜的細胞過程和每個細胞所起的作用，只能提供有限的認識。此外，需要公正的信息來了解從每個分析的細胞所獲得的獨特轉錄譜。

　　為了解決這個通量限制，產生較高容量的轉錄組數據，Amit及其同事開發出一種大規模并行RNA-seq工作流程，能夠同時破譯數百甚至數千個轉錄組，而不需要特定的標記，相關研究結果發表在今年4月份的《Science》雜志。這一工作流程的關鍵是，能夠收集單細胞樣本，然后barcode和多重RNA-seq反應。

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　　最初，通過熒光激活的細胞分選（FACS）將單個細胞分類到384孔板中。然后，利用標記的材料和三個級別的barcoding，集中處理細胞。Amit研究小組利用該工作流程，能夠測定4000多個小鼠脾臟的單細胞RNA，這些細胞被濃縮用于表達CD11c表面標記。多路復用實驗可讓1536個細胞在一個單軌道進行測序，在來自每個細胞的200和1500種不同RNA分子之間，產生22000個對齊的讀長（reads）。類似于Rinn的發現，Amit的數據也顯示大量基因的高度細胞變異，這明確表明，檢測的脾臟細胞群具有異質性，并且有機會發現新的調控因子和通路。

　　近年來，RNA-seq方法和分析工具有了很大的提高，這使得單細胞分析不僅能表明變異存在，也為研究人員提供了一種方法，來了解這一轉錄變異背后的生物學意義。