試管嬰兒植入前遺傳學診斷單細胞PCR的方法

 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）簡稱PCR技術，是近年來發展起來的一種體外擴增特異DNA片段的技術，由于其可使特定DNA片段在數量上呈指數增加至可檢測范圍，故成為基因診斷的重要方法。在PCR基礎上衍生的一些擴增技術已用于基因突變的診斷。目前單基因疾病PGD所用的方法主要是基于PCR技術通過檢測單細胞靶基因的數目及結構有無異常加以診斷。

  （一）聚合酶鏈式反應
  PCR實際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。基本原理是：用一對寡核苷酸鏈做引物，引導DNA聚合酶在引物識別位點之間兩條互補鏈上進行DNA合成，經過模板變性、退火及延伸三步為一個循環，每一循環的產物可以作為下一個循環的模板，多次循環可使特定DNA片段在數量上呈指數增加至2×l0（6一7）拷貝。
    單細胞PCR無需抽提DNA，經過變性前處理步驟后，即進行PCR循環反應。與經典PCR相比，其優點是無需制備DNA，節省時間，從獲得樣本、PCR反應到出結果只需幾個小時左右。但由于單細胞PCR的模板量極低，僅1–2拷貝，故PCR體系必須具備下列條件：①對模板擴增的忠實性好；②方法穩定；③無非特異性擴增；④擴增的靈敏度高。目前用于PGD的PCR方法主要有以下幾種：
    1．巢式PCR  由于單細胞中可檢測的僅l一2個拷貝的基因序列。為了既不影響特異性又獲得較大的敏感性，巢式引物被應用。巢式PCR設置二步PCR，只有初級PCR中特異的擴增片段才可能被二級引物擴增，可減少引物與模板非特異性位點的復性、引物二聚體的形成以及非特異背景產物的產生，從而提高了擴增特異性，而且增加了zui終產物量。
    2．多重PCR  如果與疾病相關的基因十分龐大，如杜氏肌營養不良癥（DMD），有2 OOO多kb長。這些基因常多處發生缺失或突變，而且這些改變發生在相鄰十至數百個kb的距離，超出了PCR技術所能擴增的有效長度，對此，可采用多重PCR，既在同一試管中加人多對引物，擴增同一模板的幾個區域。目前報道多重PCR反應zui多可同時擴增12條區帶。
    3．熒光PCR  指熒光標記的寡核苷酸引物。PCR產物用激光分析系統進行分析，從產物大小到核苷酸序列都能夠被準確分析。由于不同的熒光分子在激光激發下有不同波長，在片段分析結構系統中，相同大小的不同產物可以被區分開。其敏感性優于普通PCR千倍。準確性可達l一2bp。對于單細胞35–4O個循環就可以產生足夠量的產物，不僅減少了散在的、非特異的污染，而且縮短診斷時間。現該方法已廣泛用于PGD。
    4．熒光定量PCR  該技術融匯了PCR和DNA探針雜交技術的優點，反應體系中，不僅有兩條普通的引物，還有一條熒光標記探針。這條探針的5’和3’端分別標記了熒光報告基團（R）和熒光淬滅基團（Q）。當探針保持完整時，無熒光發出。PCR開始后，隨著鏈的延伸，Taq酶將熒光探針切斷，釋放出熒光信號，且信號的強弱與PCR的產物數量成正比，檢測出前者可計算出后者，從而獲取DNA模板的準確結果。該技術在完全閉管的情況下進行，無需凝膠電泳，通過特殊探頭直接探測PCR過程中熒光信號的變化，解決了常規PCR不能定量及擴增產物污染而導致的假陽性、操作復雜等問題，減少污染的可能性，提高了診斷的效率。
    5．原位PCR  此技術由HaSSe等于1990年建立，即在固定于同一載玻片上的同一個單細胞上，先用PCR原位擴增，再用FISt{檢測，目前PGD中應用該方法，PCR的有效率為65％，FISI–I達85％。遺憾的是ADO較常規PCR高。但這種新方法有效的把原位雜交技術的細胞定位能力與PCR擴增的所有潛在敏感性結合起來，相信隨著引物設計及熒光PCR與原位PCR有效的結合，其不足會得到克服，該方法也許會成為PGD的未來。

    6．免疫PCR  是PCR法與酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法的融合技術，利用了PCR的大量擴增能力和抗原抗體反應的特異性。其原理是將目的基因的擴增產物用生物素標記，檢測突變的特異性探針用地高辛標記，二者經變性退火處理后加到含抗生物素的酶標板內，通過顯色來鑒定突變是否存在。根據顯色深淺可做定量分析。該法已用于囊性纖維病基因突變的檢測。
    7．等位基因特異性擴增  在設計引物時，根據已知突變位點的特征，在引物3’端或中間設計一錯配堿基，使之僅能與突變型或野生型基因互補，而只擴增相對應的突變型或野生型基因。主要用于點突變導致的遺傳病的檢測。其優點是只需一步PCR，而無需電泳和標記，擺脫了分子生物學方法中必經電泳的現象。在相互競爭的突變型和野生型引物中，分別采用不同熒光染料標記擴增的DNA，可直接對擴增產物進行判讀。另外使用具有特定酶切位點的內嵌引物，也可提高產物特異性和產量，DNA擴增后用酶切割，由酶切產物可明確是否有基因突變，該法已應用于單個精子的DNA分析。