實驗材料
| 試劑、試劑盒 | |
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| 實驗步驟 | 3.1 種子總蛋白提取的普適方法 使用普適方法的目的在于從研磨好的種子中提取總蛋白質，不考慮具體的蛋白質種類 。此方法由 Damerval 等 [ 9] 及 Granier [ 10 ] 提出，它可以用于所有的種子，參見第 1 章 。 這種方法不僅特別適用于從綠熟種子中提取蛋白質，也適用于從早期形成階段的谷類植物籽粒，種皮、胚或正在發育的胚乳中提取蛋白質。一些特殊組織，如糊粉層、胚和胚乳能夠從發育中的籽粒及成熟的籽粒中分離出來。不像分離胚那樣容易，分離糊粉層需要時間和經驗，要在顯微鏡下剖開很多種子才能得到足夠的材料用于蛋白質提取和雙向電泳。 一株植物上收獲到的種子存在差異，所以要從有代表性的穗、花序、莢等收集未成熟的種子。 根據所使用的方法，即在溶解之前沉淀（見下文）或直接溶解（見下文），在蛋白質提取量或者在雙向電泳凝膠上的蛋白質圖譜會有所不同。不管怎樣，一旦應用了一個方法，整個實驗就必須采用此方法的操作流程。 1. 在溶解之前沉淀 來自穗、花序、莢等的綠熟材料收集后立即稱重。這些綠熟種子材料研磨之前冷凍。 ( 1 ) 將研磨后的粉末（100 mg ) 立即加入 1 ml 預冷的 TCA/丙酮提取緩沖液（見注釋 3~5) 。過夜沉淀后在 15000 g，4°C 離心 15 min。 ( 2 ) 沉淀用漂洗液洗兩次，每次洗后在 15000 g 4°C 離心 15 min。棄去上清（見注釋 6) 。 ( 3 ) 將從 100 mg 材料中得到的沉淀晾干，以去掉殘留的丙酮，然后保存在 -80°C ( 見注釋 7) 。這種方法可使蛋白質在被 1250 μl 溶解劑或者被含有如離液劑（chaotrope) 和去垢劑等特殊溶劑的 IEF 緩沖液溶解之前而高度濃縮。 2. 直接再溶解 種子中的蛋白質可以直接從研磨過的籽粒中提取，而不必先用 TCA/丙酮提取和沉淀 。用去垢劑和離液劑直接從天然組織中提取蛋白質比從沉淀中提取蛋白質更有效，而且這種方法可以防止蛋白質沉淀或者重懸不完全而造成的丟失。這里描述的方法不包含使用預冷丙酮進行的沉淀，盡管預冷丙酮在濃縮蛋白質及除去鹽和其他有機化合物上很有用。這種丙酮沉淀方法直到最近才被提出 [11] 。另一種最近被報道的方法是從發育的小麥子粒中用 KCl 增進溶解的方法提取蛋白質 [ 12，13] 。大麥中的蛋白質首次用 5 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 及 1 mmol/L CaCl2 被提出 [ 14，15 ] 。含有各種蛋白酶抑制劑、DNA 酶Ⅰ、RNA 酶、Triton X-100 和 DTT 的硫脲/尿素裂解緩沖液被用于擬南芥種子。這里描述的方法主要適用于谷類植物胚乳蛋白的提取，這種蛋白質主要由貯藏蛋白（醇溶蛋白和谷蛋白）組成。這種方法不能排除其他蛋白質，特別是許多白蛋白和球蛋白也和貯藏蛋白一起被提取出來。 ( 1 ) 材料在收集后要立即稱重，然后碾碎（見注釋 8 和注釋 9 ) 或磨碎（見注釋 10)。 ( 2 ) 將 500 μl 溶解液加入已有 40 mg 材料粉末的離心管中，渦旋混合，在室溫中孵育 1.5 h。 ( 3 ) 超聲處理（20W、20s ) 之后，將懸濁液放置 30 min 后離心（9000 g、5 min、20°C ) 。然后收集 250 μl 上清液。上清液主要含貯藏蛋白。 ( 4 ) 用考馬斯亮藍法或 2D Quant 試劑盒測定蛋白質濃度。 ( 5 ) 將 20 μl 載體兩性電解質（根據 IEF 步驟中 IPG 條梯度要求選用）和 4 μl 4-乙烯基吡啶（見注釋 11 ) 加入到 250 μl 上清液中。渦旋混合 15 min，再加入 254 μl 甘油溶液。-80°C 保存直到使用。 3.2 特定蛋白質的提取 1. 白蛋白和球蛋白 同時提取兩種蛋白質（水溶性白蛋白和鹽溶性球蛋白）已經優化應用于等電聚焦。 因此，用磷酸鈉緩沖液提取蛋白質后 [ 18 ] 得到的蛋白質先脫鹽、沉淀，然后重懸于等電聚焦緩沖液中。最近，用這種方法在雙向電泳中成功分離小麥籽粒中的白蛋白和球蛋白 [ 19 ] 。根據 3. 3.1 節 2 中描述的方法或是在注釋 8~10 中描述的方法碾磨種子（包括種皮、帶胚或不帶胚)。蛋白質提取根據以下步驟完成。 ( 1 ) 將 100 mg 材料粉末加入 1 ml 磷酸鈉緩沖液中，在 4°C 持續攪拌 2 h。離心 ( 8000 g、10 min、4°C ) ，然后取 500 μl 上清液（見注釋 13 )。 ( 2 ) 根據生產商說明，用冷水在 4°C 透析 24 h ( 見注釋 14)。 ( 3 ) 除去鹽分的樣液與 1 ml 丙酮混合，在 -20°C 反應沉淀一夜，然后離心（8000 g 4°C、5 min) 。 ( 4 ) 除去上清液，將蛋白質沉淀用預冷丙酮漂洗 3 次，每次漂洗后離心（8000 g 4°C、5 min) 。沉淀蛋白質風干后除去殘留的丙酮。 ( 5 ) 將沉淀溶于 250 μl 溶解緩沖液中，其間渦旋幾次（見 3.2.1) 。室溫下 1.5 h 后，溶解的蛋白質再用超聲處理（20 W、20 s ) ，將懸濁液靜置 30 min，離心（9000 g、5 min、20℃），收集上清液。 ( 6 ) 收集含有蛋白質的上清液，并補充 20 μl 載體兩性電解質和 4 μl 4-乙烯基吡啶。溶液進行渦旋處理，靜置 15 min。 ( 7 ) 加入 254 μl 甘油。溶液在進行雙向電泳分析之前，一直保存在 -80°C ( 見注釋 12 ) 。 2. 兩性蛋白質 這種蛋白質由兩種形式的氨基酸序列組成，一種序列富含親水的氨基酸（大部分為 Lys 、Arg 和 His) ，另一種序列富含疏水的氨基酸（如 Val、Leu 和 lie ) 。大部分膜蛋白都是兩性的。這里描述提取方法基于與其他方法做適當改良 [ 20] ，便于從小麥種子中提取兩性蛋白質 [ 21，22] 。 ( 1 ) 籽粒按照前述方法研磨（見注釋 8~10)。 ( 2 ) 取 250 mg 粉末加于 7.5 ml Triton X-114 溶液中，在 4°C 攪拌 1 h，并在 10000 g，4°C 離心 30 min。 ( 3 ) 上清液在 37°C 加熱 45 min 進行相分配，然后在 5000 g、22°C 離心 10 min。小心除去上層輕相（見注釋 15)。 ( 4 ) 將 5 體積沉淀液（大約 10 ml) 加入富含兩性蛋白質下層相。在 -20°C 沉淀過夜。 ( 5 ) 在 2000 g，-8°C 條件下離心 10 min 后，沉淀用 10 ml 二乙醚乙醇溶液漂洗 3 次，每次漂洗后在 2000 g，-8°C 條件下離心 10 min。 ( 6 ) 最后，沉淀用 5 ml 二乙醚漂洗、離心，在室溫下真空干燥。干燥后的沉淀保存在 -80°C 備用。等電聚焦時，將干燥的沉淀溶解于 250 μl 溶解液中（見 3.2.1 )。 3. 淀粉粒蛋白質 淀粉是谷類植物籽粒胚乳中的主要成分（占干重的 70%~75% ) 。源于造粉體的淀粉粒隨著種子的形成在成熟的胚乳中積累。在谷類植物種子中，淀粉粒大小分布不同 ( 圖 3-1)。以下介紹的方法用于提取谷類植物子粒中吸附在淀粉粒上或存在于淀粉粒中的蛋白質。這種方法是在關于小麥淀粉中的淀粉合酶研究的基礎上修改形成的 [ 23,24] 。 ( 1 ) 在室溫條件下，用研缽和杵搗碎 1~2 個半籽粒，并將磨碎的組織從種皮組織中分離出來（見注釋 16)。 ( 2 ) 將 40~60 mg 粉末在 1 ml 去離子水中 4°C 浸泡過夜。將懸濁液在 10000 g，4°C 離心 2 min。 ( 3 ) 然后將 300 μl 冷水加入沉淀上，并渦旋混合。 ( 4 ) 懸濁液中加入 1 ml 90%（V/V）CsCl 進行分層，在 4℃ 靜置 5 min，然后在 14000 g，4°C 離心 5 min。小心除去上清液。 ( 5 ) 然后把 1 ml 含有 CHAPS 和 DTT 的漂洗液加在沉淀上。渦旋混合，在 37°C 加熱 15 min，并每隔 5 min 渦旋一次。懸濁液在 14000 g，4°C 離心 3 min，小心除去上清液。 ( 6 ) 將淀粉粒沉淀離心（參數同前）并用水漂洗 3 次，方法如下：加 1 ml 水在沉淀上，渦旋懸濁液，室溫靜置 5 min，然后在 14000 g 4°C 離心 3 min。每次都小心除去上清液。 ( 7 ) 最后用預冷丙酮漂洗 5 min，渦旋，離心同步驟（6) 。晾干淀粉粒沉淀，稱重，并保存在 -20℃ 備用。 ( 8 ) 以 1 : 5 ( m/V ) 的比率用漂洗液重懸淀粉粒沉淀。通常，40 mg 干燥淀粉沉淀可在室溫下，渦旋懸浮于 200 μl 新配制的含有 4% ( m/V ) CHAPS 和 2%（m/V ) DTT 的溶液中（見注釋 16)。將懸浮液靜置 5 min，100°C 加熱 5 min，可使淀粉粒釋放其內含物。 ( 9 ) 將懸濁液在冰中冷卻 10 min，并在 17000 g，4°C 離心 15 min。上清液中含有強力吸附于淀粉粒上或存在于淀粉粒中的蛋白質。收集的蛋白質可以被保存在 -80°C 或直接用于雙向電泳。在進行等電聚焦時，需要將 150 μl 的溶解液（見 3.2.1 ) 加入到 100 μl 上清液中。 |