質粒構建之酶切位點的選擇

結論：一定要選擇具有相同buffer的兩個酶

技術背景：

克隆目的基因，并把其裝入表達載體轉化/轉染原核細胞/真核細胞中，是獲取目的蛋白/研究基因功能的經典方法，也是目前科研工作者常用的方法。其中酶切是該技術不可缺少的一部分，隨著載體設計技術的發展，雙酶切以其獨特的優點而逐漸取代了單酶切 。

具體實驗流程如下：

設計合成含有酶切位點，能擴增基因ORF全長的一對引物——PCR擴增目的基因——純化PCR產物——分別對PCR產物及載體進行雙酶切——分別純化雙酶切產物——連接目的基因與載體——轉化大腸桿菌——篩選陽性克隆——質粒提取——轉化/轉染——獲得重組蛋白/功能研究

酶切反應雖然是在PCR之后，但是酶的選擇卻是在PCR前引物設計時就完成了。我覺得這就是錯誤的根源！

故事：導師給我的第一個課題就是研究病毒包膜蛋白的功能，首先我需要克隆出該基因，并把它裝入真核表達載體pcDNA3.1(+)，構建重組質粒。根據pcDNA3.1(+)載體多克隆位點的內切酶排列順序，在設計引物時，我在上下游引物的5'端分別引入兩個常用的便宜得內切酶：BamHI/XhoI。引物送公司合成后，就開始實驗：PCR過程非常順利，一下就把目的基因拉出來了。但是怎么也想不到，這個載體我忙了半年也沒有構建成功。由于PCR后面的酶切，連接，轉化試驗都無法進行成功性的鑒定，試驗只有拿單克隆細菌進行鑒定。可是我的平板上始終看不到有單克隆生長。所以錯誤可能出現在PCR后的任何一個環節。

下一步就是要找出錯誤發生在哪里！最容易的鑒定就是感受態細胞了，拿載體做了一個陽性對照，結果板上密布菌落。這說明感受態細胞以及轉化的過程沒有問題。

那問題很有可能出在兩個地方：1.雙酶切沒有完全切開 2.連接沒有成功！由于師兄用同樣的兩個酶有成功的先例，所以我主觀判斷是連接出了問題！判斷的失誤導致我浪費半年的時間：購買新的T4連接酶，不停的摸索連接條件，不停的更換目的基因與載體的比例，應用平端連接的連接體系.......半年時間就在痛苦的重復和思索中過去了。老板不得已給我更換了課題！后來實驗室又要構建重組質粒，由于我“經驗豐富”，老板把這個重任又交給了我。這次在設計引物時，無意中我更換了酶切位點（目的序列中含有XhoI的序列，不可用），選用HindIII/BamHI。實驗結果出奇的順利，兩個星期內我就把測序鑒定正確的質粒大提后交給老板！

我反思：為什么我做了半年沒做出來，而這次半月就搞定了呢，極有可能使酶切的問題：BamHI/XhoI沒有共同的buffer，不管加入哪一種buffer，都有一種酶的活性只有50~70%，而HindIII/BamHI卻有著共同的buffer，在雙酶切體系中兩個酶的活性都達到100%。

為了證明這一設想，我又重新設計引物，選用HindIII/BamHI這兩個酶，結果被我一舉拿下這個重組質粒！

之后，老板把實驗室所有重組質粒的構建任務都交給了我，兩年內我成功構建了8個重組質粒。