實驗概要
掌握質粒DNA雙酶切的原理和操作方法。
實驗原理
分子生物學實驗中，基因的重組與分離涉及到一系列的酶促反應。許多種酶在基因克隆實驗中有著廣泛的用途。
限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。多種細菌能合成限制性核酸酶，這是它們保護自己，降解外來DNA分子的重要手段。每一種內切酶能識別DNA分子中由4～6個核苷酸組成的特定序列。而細菌細胞內的DNA則由于相應序列上的A或C堿基的甲基化而不被攻擊，可是外源DNA一旦進入細胞立即被識別，雙股DNA螺旋都被切斷。限制性內切酶是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。限制性核酸內切酶不僅是DNA重組中重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定。
寄主控制的限制與修飾現象：限制與修飾系統是細胞的一種防衛手段。各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內切酶，它們以此來限制外源DNA存在于自身細胞內，但合成這種酶的細胞自身的DNA不受影響，因為這種細胞還合成了一種修飾酶，對自身的DNA進行了修飾，限制性酶對修飾過的DNA不能起作用。這種現象被稱為寄主控制的限制與修飾現象。
限制性核酸內切酶的類型及特性，按限制酶的組成、與修飾酶活性關系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：
1. 第一類（I型）限制性內切酶：
能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。
2. 第二類（II型）限制性內切酶：
能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內的固定位置上切割雙鏈。這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的，因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數也有識別5個核苷酸以及7個、8個、9個、10個和11個核苷酸的。
II 型限制性內切酶的識別順序是一個回文對稱順序，即有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式：
粘性末端：
交錯切割，結果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端
如EcoRI的識別順序為：
5'…… G'AA|TT_C ……3'
3'…… C_TT|AA'G …… 5'
垂直線表示中心對稱軸，從兩側“讀”核苷酸順序都是GAATTC或CTTAAG，這就是回文順序（palindrome）。_和'表示在雙鏈上交錯切割的位置，切割后生成
5'G……… 5'.AATTC
3'CTTAA.和3'……...G二個DNA片段，各有一個單鏈末端，二條單鏈是互補的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過DNA連接酶的作用而“粘合”。
平頭末端：
II型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產生平頭末端。例如EcoRV 的識別位置是：
5'…… GAT'|ATC …… 3'
3'…… CTA'|TAG …… 5'
切割后形成5'…… GAT ATC …… 3'
3'……CTA和 TAG……5'二個片段，這種末端同樣可以通過DNA連接酶連接起來。
3. 第三類（ III型）限制性內切酶：
也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序，在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應用于基因克隆。
主要試劑
1. R-pGEX-4T-1質粒DNA
2. XhoⅠ酶（TaKaRa公司）
3. EcoRⅠ酶（TaKaRa公司）
4. 10×H Buffer（TaKaRa公司）
5. 無菌水
6. DNA marker 2000（TaKaRa公司）
7. 瓊脂糖
8. 1×TAE
9. 10mg/mL溴化乙錠溶液（EB）（0.5μg/mL終濃度，20mL膠加1μL）
10. 10×Loading Buffer:1%SDS/50%Glycerol(甘油)/0.05%Bromophenol Blue(溴酚藍)
主要設備
1. 瓊脂糖凝膠電泳系統（電泳槽、電泳儀和制膠裝置）
2. 紫外線透射儀
3. 水浴鍋
4. 10μL移液槍和槍頭
5. 制冰機
6. 浮板
實驗步驟
1. 質粒DNA的雙酶切
反應體系：
EcoRⅠ1μL
XhoⅠ1μL
10×H Buffer2μL
質粒DNA10μL～12μL≤1μg
無菌水6μL～4μL
總體積20μL（無菌水補至總體積）
反應條件：溫度37℃，酶切1小時30分鐘。
2. 瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果
制備1％瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mLEB），100V電泳25～30分鐘，最高電壓不超過5V/cm。
3. 紫外線透射儀觀察結果
4. UVP凝膠成像系統記錄結果（電泳圖）
注意事項
酶切是要注意影響核酸限制性內切酶活性的因素，如：
1. DNA的純度
2. DNA的甲基化程度
3. 酶切消化反應的溫度
4. DNA的分子結構
5. 溶液中離子濃度及種類
6. 緩沖液的 pH值等