實驗材料 菌落質粒DNA
試劑、試劑盒 CaCl2
儀器、耗材 培養基平板
實驗步驟
1. 接種一個單菌落于50 ml LB培養液中，于37°C中速搖床培養過夜（250 r/min)。
2. 往一個2 L的燒瓶中加人400 ml LB培養液，再加入4 ml過夜培養液，于37°C搖床（250 r/min）培養至 OD590為 0. 375。
這一步的目的是使細菌快速生長（對數早期或中期）。
3. 將培養液分裝到8個50 ml預冷無菌的聚丙烯管中，于冰上放置5?10 min。
4. 于4°C，1600 g離心7 min。細胞沉淀用10 ml冰冷的CaCl2溶液重懸。
5. 于4°C，1100 g離心5 min。細胞沉淀用10 ml冰冷的CaCl2溶液重懸，冰上放置30min。
6. 于4°C，1100 g離心5 min。用2 ml冰冷的CaCl2溶液重懸各管細胞。
7. 為了長期保存，按每管250 μl的量分裝于預冷的無菌聚丙烯管中，立即凍存于-70 °C。
8. 為檢測感受態的效果，按照以下各步驟將10 ng pBR322轉化到100 μl感受態細菌。
將合適體積的轉化物（1、10和25 μl）涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，37 °C培養過夜。
轉化的大腸桿菌MC1061和DH1細胞一般可以產生105~108克隆數/μg DNA。
9. 將10 ng DNA (10~25 μl)加人到一個15 ml無菌的圓底試管中，并放置冰上。
10. 將盛有感受態細胞菌的管子握在手上使菌液迅速融化，立即將100 μl感受態細菌加入到管中，輕輕旋動，并放置冰上10 min。
11. 將管放人42°C水浴2 min進行熱激，然后加人1 ml LB培養液于每一支試管中，于37 °C置滾筒式搖床（250 r/min)培養1 h。
12. 將幾個稀釋度菌液涂布于含合適抗生素的平板上，于37 °C培養12~16 h。
對氨芐青霉素來說，最適宜的密度是每個平板上的細胞≤500，這樣是為了防止弱抗性的衛星菌落的生長。
13. 短期保存，可以將平板和剩下的含質粒的細菌培養物儲存于4°C。長期保存則準備甘油或DMSO存儲液，保存于-70°C。取出保存的細胞于選擇性平板生長，用酶切檢測質粒DNA 。
注意事項
1. 所有與細菌接觸的物品和液體都應該是無菌的。
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