一、簡述
近代質粒DNA分離純化以從大腸桿菌中分離為代表，鑒于大局桿菌（E.coli）在分子生物學研究中的重要地位，從E.coli中分離純化質控DNA〈Piasmid DNA〉成為近年來超離心技術中一個重要課題。而質粒DNA的快速分離純化又對超離心設備（超速離心機、轉頭和附屬設備）提出了更高要求。
E.coli是典型的原核細胞生物，由于原核細胞缺乏其核細胞所具有的那種由單位膜組成的可把多種功能組分分隔為專一化的和局部獨立區域的內膜系統，因而沒有其核細胞所包含的細胞器（核、內質網、高爾基體、線拉體、溶酶體等等）。電鏡顯微照片顯示E.coli有兩個可以區別的內部區域一一細胞質和核質，在它們外面圍著一層較薄的細胞質膜和很厚的細胞壁，在細胞壁外部附著一些一端游離的鞭毛。質粒DNA位于核區，以細絲狀存在，這種細絲狀物在多種情況下是極長的環狀DNA的一些片斷所折疊起來的聚密體。
針對E.coli的顯微結構待點，在進行超離心分離純化質粒DNA之前的預處理順序是：
E.coli→用溶菌酶去細胞壁→用表面活性劑如SDS、Triton X-100等破細胞膜→用乙酸鈉使DNA、RNA及蛋白質大部分沉淀(90%以上)。
沉淀物可以在加入TE緩沖液(10m-MTris-HCL lmMEDTA,pH8.0)后分子篩上柱去蛋白,去RNA;也可以用超速離心法去蛋白質,去RNA，去級狀DNA或DNA斷片。本文將綜述后一種方法在近年來的新進展.
二、質粒DNA超速離心分離的最新進展
1、
傳統的分離方法：數年前，由于受設備條件限制，質粒DNA的分離一般用CsCl平衡等密度離心法，自形成梯度。以10~12ml單管容量為例，用甩平轉頭分離，36.000rpm×60小時，用角式轉頭分離45,OOOrpm×36小時，前者包括加減速在內共用去1.3億轉驅動部壽命，后者也要用去1億轉驅動部壽命，這對當時超速離心機總壽命為100~200億轉來看，無疑每次實驗費用過高，加上CsCl用量多、價格貴等因素，使這類分離純化工作成為非常昂貴的實驗。
2、新進展：
（1）超速垂直管轉頭的離心分離（欽合金或碳纖維制造的）：從1975年垂直管轉頭向世后，近年來各主要離心機生產商開發的垂直管轉頭，單管容量0.2ml到4Oml，最高轉速從50,000rpm到120,000rpm,RCFmax可達
700,000×g，90年代開發的新機型和轉頭己能夠使質粒DNA垂直管離心分離實驗做起來得心應手。
使用垂直管轉頭分離純化質粒DNA的待點是：.
·由于沉降距離最短，離心時間最短，高效、低耗：
·離心管縱向剖面積遠大子橫向截面積，離心沉降時純祥品區帶的容量較大，在沒有沉淀附著或沉淀附著很緊很密的條件下分離純度高，樣品加載量也較大；流體靜壓力,不會因靜壓過高而使生物體顆粒受到損傷.離心管內樣品顆粒受到的流體靜壓為：
式中：ω：角速度
r：樣品顆粒所在位置與旋轉中心距離（以厘米計）
r1:轉頭最小離心半徑即rmin（厘米），在使用gmax離心時是液面和旋轉中心的距離。
Pa:起始密度（對預形成梯度時為最小密度,對自形成梯度離心,為離心結束時最小密度）。
a：梯度斜率
在超速離心中，P值相當大，一般認為P≤1500kg/cm2,才不致損傷生物體顆粒，垂直管轉頭（r-r1）很小,相對說P也相當小（102數量級），而對甩平轉頭，在離心前往往要進行P值校核，過大時，應降低轉速。在用垂直管進行質粒DNA分離純化時，RNA沉淀附在離心管壁部，在減速、梯度方向轉換時,質粒DNA區帶從沉淀區"擦"過，使DNA中混入少量RNA而影響純度。
在極高轉速離心時（如大于80,000rpm），由于RNA附著壁部較緊,這種影響較小。
(2)近垂直管轉頭離心分離：為了消除垂直管轉頭用于質粒DNA離心在壁部形成的RNA沉淀對已形成的DNA區帶的污染，同時也為了改進一般斜角式轉頭（傾角25·~35·）由于沉降距離較長，因而分離時間也較長的缺點，近幾年開發了多種近垂直管轉頭（即Near
VerticalTube Rot時,簡稱NVT轉頭或Neo Angle
Rotor,小假角轉頭,簡稱NT).它們的離心管縱剖面中心軸線與離心機驅動軸線之間夾角在7.5·~10·之間,轉速從65,000rpm到120,000rpm，RCFmax可達646,000×g單管容量從2ml至13.5ml。NVT（或NT）轉頭的開發主要是為質粒DNA分離而設計，當然它也適用于線粒體DNA、染色體DNA、RNA及血清脂蛋白的分離·純化。
使用NVT（NT）轉頭分離純化質粒DNA的特點是:
離心所需時間比垂直管轉頭稍長（增加30%~40%），但比一般斜角式轉頭短（為同類斜角式轉頭分離時間的60%~70%）。
雖然因為傾角小而使RNA版離心管外壁下滑分力較小，但在加入表面活性劑(如0.1%~0.001%Triton X-100）后，RNA沉淀可以較快地滑向離心管底部（即在自形成梯度時,RNA已到達底部），在梯度轉換過程中不影響質粒DNA純度；
流體靜壓小，極高速運轉時也不會損傷生物體顆粒；
離心管縱剖面比一般角式及甩平轉頭部大，分離純度高，樣品加入量較大。
（3）不連續階梯梯度分離:質粒DNA分離純化傳統方法是采用全管CsCl自形成梯度平衡等密度離心法，離心開始時全管CsCl密度均一，樣品均勻分布其中。
CsCl自形成梯度的離心時間可以用下式計算：
式中N：實際轉速(rpm)
P:樣品（如質粒DNA）在CsCl的浮動密度
r:從旋轉中心到純樣品帶中心的距離（厘米），作為初步結算，對質粒DNA離心，r位置可定在離心管中部，r平均刊點再偏外-10%。（rmax-rmin）。
F:取決于梯度材料及溶液初始密度的常系數〈表1〉。
S20.w：樣品（質粒DNA）在20℃水中沉降系數，可參照有關文獻決定。
[注]表中TCA為三氯乙酸,TFA為三氟乙酸