實驗概要
本實驗將人Bcl-2重組質粒轉化DH5α擴增菌，轉化后在含Amp的培養基上進行篩選，生長的菌落即為含重組質粒的工程菌。含人Bcl-2重組質粒的DH5α菌用于質粒DNA的擴增，獲得的質粒將作為限制性內切酶的酶切底物DNA。
實驗原理
轉化是將外源DNA分子導入到受體細胞，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。轉化所用的受體細胞一般是限制-修飾系統缺陷變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶（R-，M-）。將對數生長期的細菌（受體細胞）經理化方法處理后，細胞膜、的通透性發生暫時性改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞。進入受體細胞的DNA分子通過復制和表達實現信息的轉移，使受體細胞具有了新的遺傳性狀。將經過轉化的細胞在篩選培養基上培養，即可篩選出轉化子（帶有異源DNA分子的細胞）。
本實驗采用CaCl2法制備感受態細胞。其原理是細胞處于0～4℃，CaCl2低滲溶液中，大腸桿菌細胞膨脹成球狀。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃90秒熱激處理，促進細胞吸收DNA得合物。將細菌放置在非選擇性培養基中保溫一段時間，促使在轉化過程中獲得的新的表型，如氨芐青霉素耐藥（Ampr）得到表達，然后將此細菌培養物涂在含Amp的選擇性培養基上，倒置培養過夜，即可獲得細菌菌落。
主要試劑
1．LB液體培養基 10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高壓滅菌消毒。
2．LB固體培養基 LB液體培養基中加1.5%瓊脂粉，高壓滅菌消毒，待泠卻至不燙手背時鋪培養皿。
3．0.1mol/L CaCl2 高壓滅菌消毒或過濾除菌。
4．氨芐青霉素 用無菌水或生理鹽水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。
主要設備
1．恒溫水浴箱
2．超凈工作臺
3．高速冷凍離心機
4．恒溫搖床
5．恒溫箱
6．消毒離心管
7．消毒tips
8．玻璃培養皿 直徑90mm
9．玻璃涂布器
10．95%乙醇
11．標記筆
實驗材料
1．人Bcl-2重組質粒 它是EcoR Ⅰ單酶切的pBluescriptⅡ KS(-)載體與EcoR Ⅰ單酶切的人Bcl-2 cDNA重組而成的，大小為4 861bp，前者是一種由pUC19質粒衍生而來的具有2 961bp的質粒載體。因此用EcoRⅠ酶切則應到空載pBluescriptⅡKS(-)載體(2.96kb)和人Bcl-2 cDNA片段(1.9kb)。配制成2g/1μl。
2．大腸桿菌DH5α 此為DNA擴增菌。
實驗步驟
1．細菌感受態細胞的制備
1) 將DH5α菌種劃線于LB瓊脂板上，37℃培養過夜。
2) 挑取單菌落接種于5ml LB培養基中，37℃振蕩培養培養過夜。
3) 次日取菌液1ml接種至含有100ml LB培養基的燒瓶中，37℃劇烈振蕩培養至約2～3h，待A600值達到0.3～0.4時將燒瓶置于冰浴10～15min。
4) 將細菌轉移到一個滅菌處理過的冰預冷的50ml離心管中。4 000×g，4℃離心10min，棄培養基，將管倒置于濾紙使最后的殘留液體流盡。
5) 加預冷的已過濾除菌的0.1mol/L CaCl2重懸菌體，置冰浴30min。4 000×g，4℃離心10min，棄培養基。
6) 再加4ml預冷的0.1mol/L CaCl2，輕輕重懸菌體，置4℃冰箱12～16h。
2．DNA重組子的轉化大腸桿菌DH5α
1) 本實驗中的DNA重組子為人Bcl-2重組質粒。在無菌條件下按每管取200μl新鮮感受態DH5α細菌置于無菌的5ml塑料離心管中，共2管，分別加入人Bcl-2重組質粒(10ng)和消毒水(作陰性對照)各5μl，輕輕旋轉以混合內容物，在冰上放置30min。
2) 42℃，熱休克90s，中途不要搖動離心管，每管加800μl無抗生素的LB培養基，于37℃空氣搖床中以150 r/min速度振搖45min，使細菌復蘇。
3) 每管取200μl加至含氨芐青霉素（Amp）的LB瓊脂平板上，用玻璃涂布器涂布均勻，室溫放置20min，使液體吸收，然后37℃倒置培養12～16h至單菌落形成。
注意事項
含人Bcl-2重組質粒的DH5α菌落平板倒置置于4℃保存，于下周進行質粒DNA的制備。