質譜常用離子源

　　無信號/熒光強度弱

　　不正確的信號補償:檢查流式細胞儀陽性單一顏色對照是否正確，通道和補償設置是否能正確地捕獲所有粒子；沒有足夠的抗體來檢測:增加抗體的量/濃度；無法接近細胞內目標:檢查目標蛋白是否在細胞內。

　　對于胞內染色，確保有足夠的通透性。為防止細胞表面蛋白質的內化，該過程應用冰冷的試劑，在冰上或 4 °C進行，以終止一切反應。加入疊氮鈉可防止表面抗原的修飾和內化帶來的熒光強度的損失。對于細胞系染色，胰蛋白酶可以引起細胞表面蛋白質的內化，尤其是細胞表面分子，可能需要更溫和的分離方法；

　　細胞內染色結合熒光分子太大:對細胞內染色實驗，熒光分子應具有較小的分子量。大分子量熒光染料會降低抗體的動力和其進入細胞的可能性；

　　激光器未對齊:確保流式細胞儀的激光器正確對齊，必要時通過運行液流檢查微球來調整路線。如果激光器不能正確對準或發生漂移時，您可能需要考慮聯系此機的客服；

　　目標蛋白不存在或處于低水平表達:確保組織或細胞類型表達的目標蛋白處于一個足夠檢測的量；

　　可溶性或分泌型目標蛋白:目標蛋白是否可溶并從細胞內分泌？需要嵌合在細胞膜上或存在于細胞質里以便流式細胞儀能很容易檢測到。通過高爾基體封閉的步驟，比如加入 Brefaldin A，可提高細胞內染色信號；

　　補償過高或增益過低:使用陽性對照再次設置流式細胞儀，利用補償以確保細胞的熒光信號不被切斷，提高增益以增強信號（在合理的范圍內）；

　　熒光分子的熒光逐漸消退:抗體可能放置時間太長或沒有避光，新鮮抗體是必需的；

　　一抗和二抗不匹配:二抗應該是和一抗來源物種相同（例如第一抗體來源于兔，就要使用抗兔的第二抗體）；

　　熒光強度過高

　　抗體濃度過高:這將導致較高的非特異性結合或非常高的熒光強度。減少每個樣本中加入的抗體量；

　　過量抗體被困:這是細胞內染色特有的問題，較大的熒光分子使抗體被困在細胞中。確保洗滌步驟充分，包括在洗滌緩沖液中加入吐溫或 Triton；

　　封閉不足,與封閉步驟一樣，抗體中加入1-3% 封閉試劑；

　　背景高或陽性細胞百分比高

　　增益設置過高或補償過低:使用陽性對照再次設置流式細胞儀，用補償減少小顆粒背景并減少增益以降低信號；

　　抗體過量:降低抗體濃度。您還可以在洗滌緩沖液中添加去污劑，以確保洗去多余的抗體；

　　觀察到兩個或多個細胞群但應該只有一群細胞

　　不止一類細胞表達目的蛋白:檢查樣品中所有細胞類型的預期表達水平，如果必要確保細胞充分分離；

　　出現細胞雙峰:細胞雙峰在圖上顯示兩倍的熒光強度的第二種細胞類型。染色前輕輕地混合細胞，在放入流式細胞儀前用吸管再次混勻，也可以篩選或過濾細胞以除去團塊（30 μm 的尼龍網）；

　　側向散射背景偏高（來自小顆粒）；

　　細胞裂解:確保樣品中細胞沒有裂解和破裂。樣品應是新鮮的并且是正確制備的。細胞不能高轉速離心或劇烈震蕩；

　　細菌污染:確保樣品不受污染。細菌會低水平自發熒光，這也會導致高粒子率。

　　低粒子率

　　每毫升的細胞數量太少:制備 1 × 10 6 個細胞/ml。確保細胞充分混合（操作要輕）；

　　細胞聚集，阻塞管道:染色前輕輕吹打幾次確保形成同源單細胞懸液。確保運行之前再次混勻。在極端的情況下，可篩選或過濾細胞以去除團塊（30 μm 的尼龍網）；

　　高粒子率

　　細胞數量過多:將細胞稀釋成 1 × 10 5至 1 × 10 6 個細胞/ml 樣品。

　　引用某實驗學生問題：

　　最近在培養肝星狀細胞，每次傳代時用胰酶消化，不到一兩分鐘，細胞就成片狀漂起。讓老師幫我傳代也是，細胞一起子就漂起來了，她說假如難以把握消化程度的話，讓我把細胞全部消化下來再離心。全部消化下來是什么意思？但是細胞成片狀漂起是不是細胞已經消化過度了呢？對細胞影響還是很大的吧，比如說影響貼壁和活力。

　　答：消化過度對細胞是有一定影響的。

　　可以采取加入小量血清抵抗胰酶的作用。

　　對待這種情況時具體操作如下；

　　加入少許血清，之后加入適量的 培養液，充分吹打成單細胞，之后轉移到滅菌的離心管中，封口膜封住，1000轉左右，離心5分鐘，小心的傾去上清，加入適量培養液，重新吹打成單細胞，之后正常操作 。