質譜流式技術在TIL研究中的應用

免疫細胞經常會出現在腫瘤組織中。它們也被稱為腫瘤浸潤性白細胞（Tumor Infiltrating Leukocyte）。這些細胞組成復雜、多變，在腫瘤發生過程中發揮著巨大的作用。目前已經成為了腫瘤免疫治療領域研究的熱點。

由于免疫細胞的異質性，需要對其進行單細胞分析才能獲得真實、全面的信息。單細胞測序技術解決了單細胞的大規模核酸檢測問題，使科學家可以從基因和轉錄水平深入研究異質性的免疫細胞。同時，質譜流式技術（Mass Cytometry）的出現，將蛋白水平的單細胞分析推向了一個新的高度。

質譜流式的原理

（利用帶有金屬標簽的抗體標記細胞，ICP-Mass做為檢測手段，質譜流式實現了幾十個通道的單細胞檢測，同時也最大程度避免了通道間的信號干擾）

在短短的1秒鐘內，一臺Helios質譜流式儀能夠檢測上千個單細胞中幾十個蛋白的表達數據。這種強大的數據獲取能力使可以在能免疫細胞分析方面大顯身手。我們知道，免疫細胞上有眾多的CD分子可以做為亞群分類的標志物，而細胞內更有大量的信號通路蛋白、轉錄因子、細胞因子等直接反映了細胞的功能。設想一下，如果可以根據自己的研究方向，在單細胞水平把自己感興趣的蛋白一起檢測，這是多么令人振奮的想法！

質譜流式可以幫助研究者實現復雜的實驗設計

以CD4+T為例，它們歷來以“變化多端”著稱，按照其成熟狀態可以分為Na?ve、TCM 、TEM、Effector T；如果按照功能分，CD4+T中含有Th1、Th2、Th17、Th22以及各種狀態的Treg亞群等等；隨著研究的不斷深入，還不斷有新的功能亞群被識別，而且這些亞群內部依然存在很大的異質性。CD8+ T細胞情況也很與此類似。對此，有研究人員嘗試用質譜流式分析了人的外周血樣本，在這個實驗中他們檢測了26個表面Marker，結果……，好吧，還是先上圖吧。

質譜流式對PBMC內T細胞亞群的精細分析

起初看到這幅圖，多少有一點“眼暈”--沒錯，T細胞的組成就是這么復雜。左邊的樹形圖其實叫做SPADE分析，是一種基于生物信息學的亞群分析方法。圖中一個個不規則的“大圈圈”就是質譜流式識別出的T細胞亞群，“大圈圈”里面繁多的彩色圓點其實是具有由表型形似的細胞組成的更小亞群。右邊的方格狀的小圖是在展示不同亞群里各個Marker的表達情況。

這樣的分析，對質譜流式技術而言，只算“牛刀小試”，遠沒有達到它的能力極限。研究人員完全可以利用其他標簽標記更多的Marker或者胞內蛋白，去研究更精細的亞群及其功能。目前，質譜流式的生產商（Fluidigm）總共提供37種不同抗體的標簽，即可以支持37種蛋白的同時檢測；在全球各地質譜流式實驗室中，已經有人實現了50多種抗體的同時檢測；而質譜流式儀本身的極限是“逆天”的135個！雖然我們未必能把這些通道全部用上，但顯而易見，未來它還有廣闊的發展空間。

Helios質譜流式儀具有很寬的檢測范圍（75~210道爾頓）

（圖中的信號峰代表已經開發出相應的元素標簽，空白的位置還有待新的元素標簽填上）

回到腫瘤浸潤性白細胞，我們簡單的看一看下面的研究實例便可以了解未來該技術在該領域的潛力。這是一個由美國德克薩斯大學、中國中山大學等多個研究單位進行的一項跨國合作科研項目。其部分研究成果發表在2015年底的《Cancer Discovery》雜志上。在此研究中，研究者利用質譜流式分析了小鼠模型上腫瘤組織的細胞組成：

質譜流式對小鼠腫瘤進行的亞群分析

（注釋: Mφ：巨噬細胞；MDSCs：骨髓來源的抑制性細胞；Dendritic :樹突狀細胞；Nonimmune TME：免疫細胞以外的腫瘤微環境細胞；PCa Cells是指腫瘤細胞。左大圖展示各個亞群，右面展示不同Marker的表達情況 ）

如上圖所示，研究者將腫瘤組織分為了數個不同的亞群，這些亞群包括腫瘤細胞和各類免疫細胞在內。通過一系列對比分析，研究人員發現MDSC細胞比例在腫瘤發生過程中比例會逐漸增大，在14周的小鼠體內MDSC已經成為主要的免疫細胞亞群，占比達58%。這提示MDSC在這種腫瘤發生過程中具有重要的作用，隨后實驗數據也證明了這一點。

值得一提的是，該研究中僅使用了17個表面Marker，所以未來可以對腫瘤進行更加精細的亞群和功能分析。

近兩年，質譜流式又迎來了一次技術飛躍，將為腫瘤免疫領域的研究產生深遠的影響，這就是成像質譜流式（Imaging Mass Cytometry）的誕生。所謂成像質譜流式，就是給質譜流式加上一個激光剝蝕模塊，使其具有組織成像功能，具體的工作原理如下：

用金屬標簽抗體對組織切片進行標記，然后利用激光剝蝕系統對其進行逐點掃描，激光照射會使標簽金屬元素揮發，氬氣流會將其帶入質譜流式儀中進行檢測。得到每個點的金屬含量后，計算機就可以重構出細胞的影像。

由于可以同時使用幾十種帶有不同標簽的抗體同時標記切片，我們可以得到同一視野下幾十種蛋白的定位圖像信息。根據一些膜蛋白的定位信息，計算機可以在圖片上識別出每個細胞的邊界，進而分析視野里每個細胞中各個蛋白的表達數據，據此可以對這些細胞進行亞群分析。

成像質譜流式對乳腺癌組織的單細胞分析（紅色標記的CD20是B細胞Marker）

這樣，我們可以識別出腫瘤組織中的免疫細胞，并且知道它屬于什么亞群，同時也知道它在組織中的位置，周圍有哪些細胞與之相護作用。這種定位信息和分類信息的同時獲得，在研究腫瘤微環境、腫瘤免疫的精細機制等等領域具有非常重要的意義。

目前，成像質譜流式所用到的激光剝蝕模塊還沒有正式的產品，未來它將做為一個質譜流式的升級模塊推出。