材料
無菌
生長液 400 ml
0.25% 粗制胰蛋白酶 10 ml
Petri 培養皿，6 cm 20 個
試管或通用玻璃容器，稀釋用 20 個
非無菌
血球計數板或電子計數儀
固定液：無水甲醇 100 ml
D-PBSA 200 ml
染料：結晶紫 100 ml
濾斗和濾紙（過濾染料）
操作步驟：
1. 胰蛋白酶消化細胞（見方案 13. 2)，制成單個細胞懸液。
2. 當細胞正在消化時:
(a) 在培養皿底面編號；
(b) 計算好每稀釋步驟所需培養液（圖 21.10)。培養液要足以有重復三次的最終稀釋量。
3. 當細胞變圓并開始浮起時:
(a) 在含有血清或胰蛋白酶抑制劑的培養液中分散單層；
(b) 細胞計數；
(c) 將細胞稀釋至：
i) 2X104 個/ml 加人兩個 25 cm2 培養瓶中，用于常規維持。
ii) 稀釋液最高濃度為 2X103 個/m l。
iii) 將 ii) 稀釋成 5 種濃度，200，100, 50,20 和 10 個/ml。
4.將五種濃度（iii) 的細胞以5ml 培養液接種于Petri培養皿中。另外在兩個6cm 的Petri 培養皿中加入2 X 103 個/ml作為對照，以防克隆培養不成功(至少要保證在最大稀釋的培養液中有細胞）。
5. 將培養皿中充 5 % CO2 并置于溫箱中。
6. 將Petri培養皿放入透明的塑料盒內，最好將盒放人限制通道人口并只用作克隆實驗的潮濕的CO2 溫箱中。
7. 溫育1～3 周直到肉眼可見集落。
8. 用結晶紫染細胞：
(a) 將培養皿中的培養液吸走；
(b) 用D-PBSA 清洗細胞，棄掉洗液；
(c)加入5ml新鮮D- PBSA ，然后加人5ml 甲醇輕柔混勻（小心避免集落漂起來）；
(d)以新甲醇5ml取代甲醇D-PBSA 混合液（50:50)，固定細胞lO min；
(e)棄去甲醇，加人過濾過的結晶紫，每6cm 的培養皿2～3ml, 要確保整個生長面被染料覆蓋；
(f) 染色 lO min。
(h) 撤去染料，過濾后倒人母液瓶中。
9. 計數每個IE 中的集落數，集落中少于50 個細胞的不用計數。放大鏡下觀察更容易計數。定出一個閾值很為重要，閾值以上者可算作集落，如果大多數的集落在100個和數f 個之間，則每個集落的設定閾值可以是50個細胞。在操作中，用肉眼進行計數是普遍的。然而，當集落數非常小（<100個細胞），則每個集落的設定閾值可以是16個細胞。16個細胞以下者即相當于4 次細胞連續分裂，則很難會有更多的細胞增殖。
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