簡介
熒光量子產率是影響熒光基團熒光壽命的一個重要因素。 熒光量子產率是物質發射熒光的總能量與吸收能量的比值。Q = photonsem photonsabs量子產率的測定方法分為相對法和法兩種。“絕對”量子產率的測量需要更加復雜的儀器，而確定熒光的“相對”量子產率則較為簡單。相對量子產率測量又分為兩種方法：“一點”法：對于稀溶液，熒光強度與激發光強度以及熒光量子產率之間有如下關系：F =KIAφ，其中F是熒光強度，K是儀器常數。激發光強度，c樣品濃度，l吸收池光徑，ε樣品吸收系數，φ量子產率。這里clε可用光密度A表示。F=KI0Aφ。將兩個溶液的熒光強度進行比較：F1/F2=K1I01A1φ1/ K2I02A2φ2若兩者使用相同的裝置和測試條件，則F1/F2= A1φ1/A2φ2,即φ1/φ2= F1A2 / A1F2分別測定待測熒光試樣和已知量子產率的參比熒光標準物溶液的積分熒光強度（即熒光光譜所包括的積）以及對一相同激發波長的入射光的吸光度（使用紫外可見光度計），帶入上述公式即可求得待測樣品量子產率。運用此公式時一般要求吸光度低于0.1（zui好0.05）。第二種就是威廉姆斯等人的“比較法”，該方法使用特征明確的熒光量子產率已知的參照物，選取4-6組濃度，吸光度在0.1-0.01之間逐漸遞減（當然0.05-0.01更好），每一個濃度對應測量一個熒光積分，然后算出斜率，兩個物質的斜率再相比得出熒光量子產率。在該實驗中，采用了比較法，而通過與參照物羅丹明6G（其熒光量子產率為0.95）比較，來確定了羅丹明B的熒光量子產率。
試劑和儀器
1.羅丹明B，羅丹明6G：通常用作熒光分析時檢測DNA、RNA和蛋白質的試劑。
2. 乙醇
3.Evolution201紫外可見分光光度計
4.Lumina熒光分光計
5.Luminous軟件軟件
6.熒光比色皿(光束路徑長度為10 mm)。
實驗步驟
1.羅丹明B和羅丹明6G各制備4至5個樣品，在激發波長為535 nm時具有不同的吸光度（0.01-0.1）。
2.固定激發波長為535nm，測量制備的樣品熒光。
3.計算全光譜熒光強度（即熒光光譜的面積）
4.繪制一張全光譜熒光強度對比吸光度的圖。
5.計算熒光量子產率
儀器參數
掃描模式：發射 激發狹縫：2.5 nm
數據模式：熒光 發射狹縫：2.5 nm
重復次數：1 激發光濾鏡：空氣
重復間隔：1 激發光濾鏡：空氣
PMT電壓：700 V 激發波：535 nm
掃描速度：300 nm/min 發射開始：500 nm
積分時間：20 ms 發射結束：700 nm
應答時間：0.1 s
實驗結果
圖3.是羅丹明6G與羅丹明B的吸光度和熒光光譜。熒光光譜的面積可利用圖4中面積計算方式計算得出。
圖3：羅丹明6G（上）與羅丹明B（下）的吸光度（左）和熒光（右）光譜。
圖4熒光光譜面積
表1：吸光度對比熒光光譜面積
利用以下公式計算量子產率：Grad n2 Q = Q R GradR nR2
其中，Grad是從全光譜熒光強度與吸光度圖中獲得的線性擬合梯度。n是溶劑的折光率，下標R是指已知量子產率的參考熒光團。如果在參照物和未知樣品中均采用乙醇作為溶劑，(n2/n2R)將為1，因此熒光量子產率(Q)只有在計算Grad之后才能得出。實驗得出的吸光度對比熒光面積圖以及線性擬合的結果如圖5所示。
圖5. 吸光度對比熒光面積
在公式中插入Q值0.95（以羅丹明6G的熒光量子產率作為參考），然后計算如下
1099720 | (1) = 0.69 | |
QB = 0.95 | 1518080 | |
zui終，得出的羅丹明B的熒光量子產率為0.69，非常接近文獻量子產率 0.7。
一點法對比梯度法
一點法用于確定熒光量子產率，其優點是能比梯度法更快獲得結果。利用以下公式計算未知樣品的量子產
率：an style="mso-spacerun:'yes';font-family:'Times New Roman';font-size:14px;" >0.95
I | OD n2 | ||
Q = QR IR | OD nR2 | ||
R |
其中，Q是熒光量子產率，I是全光譜強度，n是溶劑的折光率，OD是光密度。下標R是指已知量子產率的參考熒光團。
通過比較，比較法準確性優于單點法測試。