轉基因小鼠制備實驗方法

實驗概要

掌握轉基因小鼠制備基本實驗方法。

實驗步驟

1. 選取7~8周齡雌性小鼠，陰道口封閉，作為供體，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG（10 IU）。

2. 47~48小時后，每只小鼠腹腔注射HCG（0.8 IU），并與正常公鼠合籠；另取數只適齡母鼠（2月齡以上）作為受體，陰道口潮紅，與結扎公鼠合籠。

3. 第二天上午9:00前觀察供體、受體，有精栓者拿出備用。受體籠拿出作好隔離措施。

4. 10:30左右，斷頸處死供體，手術取出整個輸卵管，放入透明質酸酶~0.3mg/M2液中。顯微鏡下，用鑷子撕開輸卵管壺腹部，受精卵隨同顆粒細胞即一同流出。

5. 仔細觀察放在透明質酸酶M2液中的受精卵，當受精卵周圍的顆粒細胞脫離時，將受精卵吸出，放入M2液中洗滌，最后放在M16液中放入5% CO₂，37℃培養箱培養。

6. 在顯微鏡下觀察，挑選細胞飽滿，透明帶清晰，雄原核清晰可見的受精卵待用。

7. 安裝持卵針和注射針，使其末端平行于載物臺，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆蓋石蠟油，移入待注射的受精卵。DNA在注射針中的氣泡應在先前全部彈走。

8. 在高倍鏡下，將注射針輕觸持卵管，使DNA緩慢流出并控制其流量；反復吹吸受精卵，使其處于最佳位置，將注射針刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。將注射過的和未注射過的受精卵上下分開放置，不致于混攪，注射完畢后，放入5% CO₂，37℃培養箱培養。

9. 將受體麻醉，注射計量為1%戊巴比妥鈉0.01ml/g，腹腔注射。手術取出卵巢連接輸卵管，用脂肪鑷固定，在顯微鏡下找到輸卵管開口。吸取注射后經培養成活的受精卵，吸取方法是先吸一段較長的M2，吸一個氣泡，然后吸取受精卵，盡量緊密排列，再吸一段液體，吸一個氣泡，再吸一段液體，共四段液體三個氣泡。除較長的那段液體，其余的液體大致1cm左右，氣泡0.2cm左右。將移植管口插入輸卵管口，輕輕將移植管內的液體吹入，看到輸卵管壺腹部膨大并清晰地看到三個氣泡，即移植成功。將卵巢連同輸卵管放回腹腔，縫合肌肉和皮膚。

10. 受體每隔一個星期稱體重一次，當第二次比第一次稱重增加時，即可初步判斷懷孕。手術后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、編號，剪尾，交分子組檢測。

注意事項

一般選取4-5周齡的雌鼠作為供體，此時的小鼠卵數較多，狀態較好。用pms誘導卵細胞成熟，用hcg超排。