轉基因植物Gus報告基因的檢測

一、原理

Gus (b-glucuronidase)基因作為一種報告基因，在植物遺傳轉化研究中有廣泛的用途。Gus基因來自于大腸桿菌，編碼b－葡聚糖苷酶（一種水解酶），可催化底物5－溴－4－氯－3－吲哚葡聚糖醛酸苷（5－bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide，縮寫為X－Gluc）分解，產生肉眼可見的深蘭色化合物，借此用來觀察轉基因植物中外源基因的表達情況，鑒定轉基因植株。

二、目的

了解轉基因植物中基因表達的器官、組織和細胞的特異性，掌握Gus報告基因表達的組織化學定位的方法。

三、材料與試劑

1、轉基因植物的組織、器官、種胚或幼苗。

2、同種非轉化植物的組織、器官、種胚或幼苗。

3、50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)。

4、染色液：100mM　K3[Fe(CN)6], 100mM K4[Fe(CN)6] 10mM Na2EDTA, 0.001% (v/v) triton X-100, 20%甲醇，0.5mg/ml X-Gluc, 磷酸緩沖液(50mM, pH 7.0)。

5、70％乙醇。

四、操作步驟

1、將準備好的材料沖洗干凈，用吸水紙吸干，浸在上述染色液中37℃恒溫條件下保溫過夜。

2、轉入70％乙醇中脫色2－3次，去除葉綠素，至陰性對照材料呈白色時為止。

3、肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景上的蘭小點即為Gus基因表達的位點。

4、83％、95％、100％乙醇中脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

5、常規石蠟切片法切片，番紅染色。

6、顯微鏡下觀察、拍照。

五、說明

1、要設立嚴格的陰性對照，即用同樣的未轉化的材料按相同的方法同時進行染色。如陰性對照顯示蘭色，其原因可能是：A）材料和試劑被細菌感染；B）保溫時間過長。

2、染色液中的甲醇可抑制細菌生長，長時間染色可加入0.02% NaN3或100mg/ml的氯霉素，短時間染色也可以不加。

3、葉綠體含量高的材料染色后要進行脫色。