轉膜時甲醇的作用

　　轉膜

　　將電泳后分離的蛋白質從凝膠中轉移到固相載體（例如 NC 膜）上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法毛細管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉移方法有濕轉和半干轉。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。前者操作容易，轉移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉移，所用緩沖液少。

　　轉移膜的選擇

　　雜交膜的選擇是決定 Western blot 成敗的重要環節。應根據雜交方案、被轉移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質、孔徑和規格的雜交膜。最常的轉移膜主要是硝酸纖維素（Nitrocellulose, NC）膜和聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE 纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和 NC 膜的特點相似,主要用于核酸雜交。

　　硝酸纖維素（NC）膜

　　NC 膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物，在低離子轉移緩沖液的環境下，大多數帶負電荷的蛋白質會與膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。無需預先活化，對蛋白質的活性影響小；非特異性本底顯色淺；價格低廉，使用方便；韌性較差，易損壞。

　　聚偏二氟乙烯(PVDF)膜

　　PVDF 膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團，使其更容易與帶負電荷蛋白結合。

　　膜的選擇主要根據

　　1、 膜與目的蛋白分子的結合能力（也就是單位面積的膜能結合蛋白的載量） ，以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大小） ；

　　2、不影響后續的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好） ；

　　3、如果后繼實驗有其他要求， 比如要做蛋白測序或者質譜分析， 還要根據不同目的來挑選不同的轉移膜。

　　轉膜注意事項

　　1

　　泡膜

　　轉膜之前將海綿、膠、膜都用預冷的轉移 buffer 浸泡 20min。

　　a. 凝膠若是沒在預冷的轉膜 buffer 中浸泡，就會在轉膜過程中出現凝膠皺縮，導致出現轉移條帶變形。

　　b. PVDF 膜具有疏水性，需用甲醇浸泡。

　　2

　　轉膜順序

　　陰極碳板+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板。

　　3

　　轉膜條件

　　a. 冰浴中進行轉膜（轉膜過程產生大量的熱，注意冷卻）；

　　b. 具體轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，反之則短。

　　4

　　其它注意事項

　　a. 避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉膜效率并會使膜臟掉。

　　b. 夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導致轉膜不完全。

　　c. 保證膜和濾紙的大小和凝膠完全一樣，過大和過小都會影響轉膜效率。

　　d. 雞來源的抗體與 PVDF 和尼龍膜有較強的結合能力，從而產生較高的背景，故如果選擇雞來源的抗體最好使用硝酸纖維素膜（NC 膜） 。