辛酸／硫酸銨法提純IgG

一、原理

在酸性條件下( pH4.5)，非1gG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短鏈脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要為IgG，再用硫酸銨沉淀上清，即可獲得純度較高的IgG。辛酸/硫酸銨法比硫酸銨法能夠獲得更高純度的IgG。

二、材料與方法

1、材料

（1）動物腹水

（2）辛酸(caprylic acid，CA)，化學純

（3）硫酸銨，分析純

（4）SPA Sepharose 4FF親合層析柱

2、操作方法

（1）蛋白含量測定

紫外分光光度法測樣品在波長260nm，280nm處的I及收光度(A 260, A 280)，蛋白含量按以下公式計算

蛋白量（g/L）=(1.45* A 280- 0.74* A 260)*稀釋倍數

（2）主要步驟

①腹水濾紙過濾去沉淀和脂質，濾液用4倍體積60mmo1/ L醋酸緩沖液(pH4.0)稀釋后，用Na0H調，PH值至4.5。

②逐滴加入辛酸(終濃度25u1/ml)，室溫h攪拌30分鐘后，以6000-8000r/min.離心30分鐘，收集上清液。

③上清液經濾紙過濾2次，將濾液與10*PBS(0.lmol/L，pH7.4按10:1比例混合，調pH至7.4,置冰浴冷至40度。

④每毫升上述混合液加0.2778固體硫酸錢，40度攪拌30分鐘，以4000-6000r/min離心巧一20分鐘，將沉淀溶于少量YBS，透析，測蛋白含量，凍存。

（3）硫酸銨沉淀法

按常規方法將腹水分別經50%，33%飽和度硫酸銨沉淀。

（4）親合層析

取提取的樣品，用0.01lmol/ L Na2HPO4 (pH7.4)透析，洗脫使樣品中IgG結合于層析柱上，再用0. lmol/ L檸檬酸(pH4.0)洗脫，收集洗脫液即獲純化IgG。

（5）SDS—PAGE電泳鑒定抗體純度

（6）間接ELISA法測定抗體效價

用sIgA包被酶標板，按常規方法測抗體效價。處理細胞，包被酶標板，測定抗體效價。

（7）得率和回收率的計算

每毫升原腹水中提取的抗體量即為得率(Y field，g/ L );提取所得抗體量與原腹水中抗體量之百分比即為回收率(Recovery，%)。