過氧化氫酶的活性測定——紫外吸收法

實驗概要

植物在逆境下或衰老時，由于體內活性氧代謝加強而使H₂O₂發生累積。H₂O₂可以直接或間接地氧化細胞內核酸，蛋白質等生物大分子，并使細胞膜遭受損害，從而加速細胞的衰老和解體。過氧化氫酶可以清除H₂O₂，是植物體內重要的酶促防御系統之一。因此，植物組織中H₂O₂含量和過氧化氫酶活性與植物的抗逆性密切相關。本實驗利用紫外吸收法測定過氧化氫酶活性。

實驗原理

H2O2在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度(A240)隨反應時間而降低。根據測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。

主要試劑

0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液（內含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
  0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標定）。  

主要設備

紫外分光光度計；離心機；研缽；250ml容量瓶1個；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水浴；

實驗材料

受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官。

實驗步驟

1.酶液提取：
稱取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入2～3ml   4℃下預冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數次，合并沖洗液，并定容到刻度。混合均勻將量瓶置5℃冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。5℃下保存備用。
  2.測定：
取10ml試管3支，其中2支為樣品測定管，1支為空白管，按表1順序加入試劑。

表1  紫外吸收法測定H₂O₂樣品液配置表

     25℃預熱后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數1次，共測4min，待3支管全部測定完后，按下式計算酶活性。    
3.結果計算：      以1min內A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）。       過氧化氫酶活性(u/gFW/min)= (ΔA240*VT)/(0.1*V1*t*FW)  式中   ΔA240 = AS0－(AS1-AS2)/2           AS0—加入煮死酶液的對照管吸光值；           AS1, AS2—樣品管吸光值；           Vt—粗酶提取液總體積（ml）；           V1—測定用粗酶液體積（ml）；           FW—樣品鮮重（g）；           0.1—A240每下降0.1為1個酶活單位（u）；           t—加過氧化氫到最后一次讀數時間（min）。
 

注意事項

凡在240nm下有強吸收的物質對本實驗有干擾。