過氧化氫酶活性的測定

過氧化氫酶的活性測定——紫外吸收法

【原理】

H2O2在240nm波長下有強烈吸收，過氧化氫酶能分解過氧化氫，使反應溶液吸光度(A240)隨反應時間而降低。根據測量吸光率的變化速度即可測出過氧化氫酶的活性。

【儀器與用具】

紫外分光光度計；離心機；研缽；250ml容量瓶1個；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml試管3支；恒溫水浴；

【試劑】

0.2mol/L pH7.8磷酸緩沖液（內含1%聚乙烯吡咯烷酮）；

0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高錳酸鉀標定）。

【方法】

1.酶液提取：稱取新鮮小麥葉片或其它植物組織0.5g置研缽中，加入2～3ml 4℃下預冷的pH7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數次，合并沖洗液，并定容到刻度。混合均勻將量瓶置5℃冰箱中靜置10min，取上部澄清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。5℃下保存備用。

2.測定：取10ml試管3支，其中2支為樣品測定管，1支為空白管，按表40-2順序加入試劑。

表40-2 紫外吸收法測定H2O2樣品液配置表

管 號
S1
S2
S3

粗酶液(ml)
0.2
0.2
0.2

pH7.8磷酸(ml)
1.5
1.5
1.5

蒸餾水(ml)
1.0
1.0
1.0

25℃預熱后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數1次，共測4min，待3支管全部測定完后，按下式計算酶活性。

3.結果計算：

以1min內A240減少0.1的酶量為1個酶活單位（u）。

過氧化氫酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的對照管吸光值；

AS1, AS2—樣品管吸光值；

Vt—粗酶提取液總體積（ml）；

V1—測定用粗酶液體積（ml）；

FW—樣品鮮重（g）；

0.1—A240每下降0.1為1個酶活單位（u）；

t—加過氧化氫到最后一次讀數時間（min）。