簡介
ACQUITY Arc系統能夠在同一個平臺上運行HPLC和UHPLC分離，是一款可以填補HPLC與UPLC?之間的性能差距的LC平臺。利用Arc Multi-flow path?技術，用戶可在流路1與流路2之間輕松切換，從而實現無縫的方法轉換或改善現有方法。此前的研究表明，ACQUITY Arc系統能夠輕松轉換單克隆抗體的SEC-HPLC方法1以及CEX-HPLC方法2。這兩項研究均采用流路1來模擬HPLC分離，而且兩次分析的結果表明系統之間的相對保留時間、峰面積百分比和分離度幾乎相同。本應用紀要的目的是展示不同LC平臺之間進行肽圖分析方法轉換的等效性。
肽圖分析已成為生物制藥行業的一項常規分析，通常采用平臺檢測的方式進行。肽圖可用于表征蛋白質的氨基酸序列，從而對蛋白質進行鑒定以及表征翻譯后修飾。在產品的商業轉化過程中，肽圖常被用于批釋放測試或在鑒定完成后用于基因穩定性檢測3。肽圖并不是一種通用的方法，分析人員必須針對特定的目標蛋白質專門開發分析方法4。為了獲得高重現性的肽圖，每種分析方法都必須考慮酶解和分離因素，只有這樣才能準確評估鑒定結果以及與穩定性、安全性和有效性相關的關鍵質量屬性(CQA)。
由于為特定的蛋白質建立肽圖有一定的難度，本應用紀要將一個60分鐘的通用平臺方法從Agilent 1100系列HPLC轉換至ACQUITY Arc系統，并對方法轉換過程進行了評估。然后，在兩款不同的ACQUITY Arc系統上應用該方法，通過對比所得的結果評估系統之間的差異性。最后，除光學檢測技術之外，我們還使用ACQUITY QDa質譜檢測器演示了如何將質譜檢測技術應用于這類分析。
實驗
樣品描述
取90 μL 10 mg/mL的英夫利昔單抗，用二硫蘇糖醇進行還原處理，并使用碘乙酰胺進行烷基化處理。加入胰蛋白酶酶解樣品(酶與底物之比為1:20)，然后在37 °C下水浴18小時，
最后加入純TFA使胰蛋白酶失活。酶解后樣品的最終濃度約為0.4 mg/mL，無需進一步稀釋，直接進樣分析。
LC條件
LC系統： 配備2489 UV/Vis檢測器和QDa質譜檢測器的ACQUITY Arc系統，流路1
配備四元泵和DAD檢測器的Agilent 1100系列HPLC系統
擴充定量環： 100 μL
吸收波長： 214 nm
采樣速率： 20 Hz
色譜柱：XBridge BEH C18 130?,3.5 μm, 4.6 mm x 100 mm (部件號186003033)
XBridge BEH C18 XP 130?, 2.5 μm, 4.6 mm x 100 mm(部件號186006039)
柱溫： 40 °C
流動相A： 含0.1% (v/v) TFA的H2O
流動相B： 含0.1% (v/v) TFA的乙腈
樣品溫度： 4 °C
進樣體積: 75 μL
梯度:
QDa設置
采樣速率： 2 Hz
質量數范圍 ： 350 to 1250 Da
錐孔電壓： 10 V
毛細管電壓： 1.5 kV
探頭溫度： 500 °C
數據管理
Empower 3 CDS軟件，SR2