透射電鏡生物制樣超薄切片

　　這是一個為電鏡觀察提供極薄（約為60nm）的樣品切片的過程，它是整個制樣程序的中心環節。大部分生物樣品只有被切割成超薄切片的形式才能在電鏡下進行觀察。能否提供理想的超薄切片關系到能否進行電鏡觀察，以及能否有令人滿意的觀察效果。在此以前的環節都是為了能給切片提供一個合格、切割性好的樣品，而最后的染色是為了增加超薄切片的反差以利觀察，因此超薄切片是最重要的環節。超薄切片的好壞與切片機的性能、切片刀的質量、包埋塊的切割性能及操作者技術經驗等因素密切相關。

　　1.包埋塊的修整：聚合好的包埋塊需要除去組織周圍多余的包埋介質，使組織露于包埋塊的尖端，并將組織塊頂面修成適當的形狀和大小，再進行切片。 方法：將包埋塊夾在專用夾持器上，用單面刀片首先在其頂端修切，暴露出樣品，然后在包埋塊四面修出與頂面成45度斜面的錐體形，頂端的切面可以大略修成梯形、矩形等形狀，并做一記號（如去掉一角），以便于光學定位。

　　2.半薄切片：為了克服超薄切片的盲目性和電鏡視野的局限性，提高電鏡觀察效果，在進行超薄切片前，需先進行半薄切片并染色，以便在光學顯微鏡下檢查和較準確地選擇超薄切片的部位進行光學定位。 2.1 切片制作方法：先在載玻片上涂一薄層牛血清，待其干燥后滴一滴雙蒸水。在超薄切片機上使用玻璃干刀切1.5mm左右半薄切片，用鑷子將切片轉移到水面上，在70～80℃電熱板烤干，切片即可貼緊于載玻片上。為防止在下面的染色過程中掉片子，每塊樣品可切3～5片半薄切片。 2.2 蘇木素-伊紅染色： ①在切片上滴2.5％過碘酸水溶液，置染色盤中，再放40℃恒溫箱10～15分鐘，自來水洗5分鐘，過蒸餾水，烤干。 ②滴蘇木素液于切片上，60℃染色20～30分鐘，自來水洗5分鐘，過蒸餾水，烤干。 ③1％伊紅滴染15分鐘，60℃，自來水洗5分鐘，過蒸餾水，烤干。 ④中性樹膠封蓋。 在制作切片過程中注意要在電熱板上烤干片子，而不能讓其自然干涸，否則切片將貼不緊，易在染色過程中脫落。過碘酸氧化時，溫度應控制在40℃不得超過，氧化的時間亦得嚴格控制，否則切片會折皺。染色盤中要保持一定的濕度，以防染液蒸干而污染切片或著色不勻。

　　3.定位修塊：光鏡下觀察染好的半薄切片，選擇要進一步觀察其超微結構的組織細胞，并找出塊上的相應位置，在顯微鏡下用雙面刀片將周邊其余的組織修去，留下進行超薄切片的組織面積不要大于0.5mm2。

　　4.超薄切片的制作： 4.1 清洗銅網：將曾使用過的銅網先用濃HCl浸泡5分鐘，自來水洗數次，無水丙酮泡洗后，鋪于濾紙上自然晾干，待用。清洗的目的是為了去除銅網上舊的支持膜、切片和其它污染物，以便支持膜與銅網得以牢固的貼附。 4.2 制備支持膜：銅網上需鋪一層支持膜以承載面積很小的超薄切片，使之有所依附而得到穩固。支持膜的厚度約為10nm，太薄時易出現切片漂移或被電子束打破的現象，太厚時則會降低圖象的分辨率。其方法是：先將干凈載玻片浸入0.4％火棉膠醋酸異戊脂溶液中，提出載玻片并直立于濾紙上待干后即在載玻片上形成薄膜。用鑷子尖沿玻片邊緣劃斷膜的四邊，將載玻片插入玻璃平皿的雙蒸水中，使薄膜與載玻片剝離而漂浮于水面上；再將洗凈的銅網凸面貼膜，排列于膜上，最后用干凈載玻片撈起支持膜及銅網，烤干備用。 4.3 切片：用45度角玻璃刀，以6度間隙角在超薄切片機上切片，切片厚度為60～70nm，在顯微鏡下呈銀白干涉光。用睫毛撥針將水槽液面上的切片聚攏起來，再用鉑金環將其撈于環上，借助環上水的表面張力，使切片保持平整，而后貼到載網上，最后將載網置于濾紙上晾干，則切片就附于網上。 切片的厚度要適當，較薄的切片分辨率較高，但反差較弱；而較厚的切片反差雖好，但分辨率則較差。切片速度的控制也很重要，通常為2～5mm/秒，以避免速度過高時刀與樣品塊之間發生一種高頻振動而導致切片出現顫痕。沒有顫痕、皺褶、重疊、刀痕及空洞，厚度適中，薄厚均勻，結構清晰是理想超薄切片的衡量標準。由于樣品的取材、脫水、浸透、包埋和切片諸個環節、各種因素都會影響到切片的質量，因此優質超薄切片的獲得，離不開每個環節的規范操作。