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  • 發布時間:2020-08-10 22:29 原文鏈接: 通過甘油分級梯度離心純化λ噬菌體顆粒實驗

    實驗方法原理 本方案適用于制備噬菌體原種、制備噬菌體顆粒(用來獲得 DNA 進行亞克隆)以及制備 λ 噬菌體臂。

    實驗材料 λ 噬菌體顆粒懸浮液

    試劑、試劑盒 EDTA甘油SM胰 DNase Ⅰ

    儀器、耗材 Beckman SW41 或 SW28 轉子或相當型號離心管

    實驗步驟

    一、材料


    1. 緩沖液和溶液


    EDTA ( 0.5 mol/L,pH 8.0 )


    甘油(5% 和 40%,V/V ) 于 SM 中


    SM


    2. 酶和緩沖液


    胰 DNase Ⅰ (1 mg/ml)


    胰 RNase 于 TE 中(1 mg/ml,pH 7.6)


    3. 離心機和轉子


    Beckman SW41 或 SW28 轉子或相當型號,配有清亮的離心管(如 Beckman 超亮離心管)


    4. 載體和菌株


    λ 噬菌體顆粒懸浮液


    二、方法


    1. 在 Beckman SW41 聚碳酸酯離心管(或相應離心管)中制備甘油分級梯度(每管加 5 ml 噬菌體懸浮液):


    (1) 取 3 ml 含 40% 甘油的 SM,加入至離心管管底。


    (2) 在 40% 甘油溶液上小心加入 4 ml 含 5% 甘油的 SM。


    (3) 在 5% 甘油的頂層小心加入噬菌體懸浮液,最后用 SM 補滿。


    2. 分級梯度于 4℃ 151000 g ( 35000 r/min 于 Beckman SW41 或 SW28 轉子中)離心 60 min。


    3. 去上清,每升培養物原液加 1 ml SM 重懸噬菌體沉淀。


    4. 加胰 DNaseⅠ和 RNase 至終濃度分別為 5 μg/ml 和 1 μg/ml,37℃ 溫育 30 min。


    5. 加 0.5 mol/L 的 EDTA 儲液(pH 8.0) 至終濃度為 20 mmol/L。


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