實驗方法原理
實驗材料 PK-120
試劑、試劑盒 Sephadex-50Gene Amp RNA PCR 試劑盒合成寡聚核苷酸抽提液酵母 tRNA
儀器、耗材 PCR 擴增儀
實驗步驟
實驗所需「試劑」具體見「其他」
1. 引物設計
PK-120 部分分解多肽氨基酸序列中，最長序列 K-15，16 為引物設計的依據：
1.1 考慮全部編碼的組合，
1.2 考慮人編碼的使用頻率，設計 PCR 引物，正義鏈及反義鏈如用這些引物獲得的 PCR 產物當中，50 bp 的產物為目的 cDNA。
2. PCR 擴增
從肝臟來源的 poly（A）+ RNA 中，用 Gene Amp RNA PCR 試劑盒如以下所述，合成 cDNA 0.1ug 的 poly（A）+ RNA 中，加入 5 mmol/L MgCl2：
1×PCR 緩沖液Ⅱ，
2 mmol/L dNTPs，
1u 的 RNase inhibitor，
2.5 umol/L random hexamers
2.5 u 反轉錄酶，
混勻，總體積為 20 ul。
在 PCR 擴增儀上反應，PCR 參數為 ：
25℃ 10 min，
42℃ 30 min，
99℃ 5 min，
25℃ 5 min ，
第 1 循環反應，合成 cDNA。
在反應液中再分別加終濃度為 2 mol/L MgCl2，1×PCR 緩沖液Ⅱ，加 1nmol 3' 引物 5' 引物。混合，總體積為 100 ul。
94℃ 3 min 1 循環。
94℃ 1 min，
37℃～42℃，2 min，
72℃， 2 min，
40 循環。
72℃， 7 min，1 循環。
3. 凝膠電泳及提取 DNA
純化 PCR 產物后，在 0.25×TBE 溶液中，進行 10％ 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分子量標準使用限制性酶 Msp1 消化的質粒 pBR322。電泳結束后，凝膠經溴化乙錠染色，紫外照射，觀察到 50 bp 的 PCR 產物。將這 50 bp 的條帶切下，在抽提液中，室溫放置過夜之后 1200 r/min 4℃ 離心 10 min，回收上清。反復操作兩次，用乙醇沉淀 2 次，用 TE 液溶解，上樣 Sephadex-50 柱，再用乙醇沉淀洗脫組分，沉淀懸浮于 TE 溶液中。
4. 測定堿基序列
抽取提出的 PCR 產物用 PCRⅡ載體亞克隆，測定堿基序列。其結果以肝臟 poly mRNA 為模板，據引物 S15-i 和 A15-i 擴增的 50 bp 的 PCR 產物序列，和從氨基酸序列預測的堿基序列完全一致。表明這是編碼母的部分分解多肽的 cDNA。
注意事項
其他
試劑：
Sephadex-50
Gene Amp RNA PCR 試劑盒
合成寡聚核苷酸用 BIO-SYNTHESIS，INC 公司產品合成寡聚核苷酸
抽提液
750 mmol/L 醋酸銨-10 mmol/L 醋酸鎂-0.1 mmol/L EDTA-0.1％SDS-1％TE 飽和酚
25ug/ml 酵母 tRNA
其他他試劑均為市售