配制培養基時先將貯存母液按順序排好，將潔凈的各種玻璃器皿放在指定的位置。
（1）稱出規定數量的瓊脂和蔗糖，加水直到培養基最終容積的34，加熱溶解，完全融解后的溶液是透明的。在配制液體培養基（不加瓊脂）時無需加熱。
（2）按需要加入一定量的各種貯存母液，包括生長調節物質和其他特殊附加物。吸取母液要使用專一的移液管。如有必要，培養基中所需的維生素，可在高壓滅菌之后通過減壓過濾裝置或微孔過濾器滅菌后再加入。
（3）蒸餾水定容。充分混合后調節培養基的pH，一般以5.66.0為好。（4）培養基分裝，分裝量一般以占培養容器的1514為宜。之后在24h內完成高壓滅菌，也可以高壓滅菌后再進行培養基的無菌分裝，室溫下存放備用。暫時不用的培養基應放置于10攝氏度下保存，而含有生長調節物質的培養基在45攝氏度保存更佳。含IAA或GAsubscript3subscript的培養基應在配制滅菌后1周內用完，其他培養基應在消毒后2周內用完，至多不超過1個月，以免干燥變質。