實驗方法原理 剪接反應的典型做法是使用核提取物，即 S100 提取物補充 SR 蛋白或粗提取物的部分純化組分，最常使用的是 HeLa 細胞的提取物。前體 mRNA 底物通常采用噬菌體聚合酶體外轉錄的方法來制備。
實驗材料 tRNAUTPRNA 聚合酶
試劑、試劑盒 YPTris-HCl ETDASDS甘油HEPES 鉀鹽DTTPMSF磷酸鉀緩沖液D-山梨醇SB 緩沖液等滲液裂解液AGK 緩沖液TBETE 亞精胺轉錄緩沖液NTPATP二氯乙酸乙酸鈉RNA 洗脫緩沖液乙酸銨乙醇染色液蛋白酶 K 溶液乙酸鈉-EDTA 溶液Tris 堿平衡酚過硫酸銨硅烷化溶液RNasin
儀器、耗材 離心機搖床Dounce 勻漿器瓷質研缽研杵透析袋Dewar 燒瓶防低溫手套真空濾膜架電源玻璃板聚四氟乙烯梳子和墊片黃色膠帶聚丙烯培養試管Quicksep 柱臺式振蕩器旋轉真空濃縮儀
實驗步驟
一、材料與設備
1. 剪接提取物制備用溶液
除非另有說明，所有溶液均以蒸餾水制備。
(1) YP：加 20 g 酵母提取物和 40 g 蛋白胨（hacto peptone ) 到 1 L 的去離子水或者蒸餾水中。加 50 g 無水 D-葡萄糖到 70 ml 水中并在加熱盤上攪拌溶解，用水補充至 100 ml 以制備 50% ( m/V ) 的葡萄糖溶液。將 YP 在一帶塞的 2800 ml Fcrnbach 燒瓶或者 4 L 燒瓶中高壓滅菌，50% 葡萄糖存放在帶螺絲帽的瓶中，于室溫儲存。使用前每升 YP 加 40 ml 的 50% 葡萄糖。葡萄糖在高壓火菌后再加入 YP 中，以防止因高壓滅菌過久而焦糖化。
(2) 1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.6，pH 7.8 和 pH 8.0）：加 30.29 g Tris 堿到 125 ml 水中，接著加入 92 ml 1 mol/L HCl。用 1 mol/L HCl 滴定調 pH 至 7.6，7.8 或者 8.0，加水至 250 ml。高壓滅菌后室溫保存。
(3) 4 mol/L NaCl，高壓滅菌后室溫保存。
(4) 0.5 mol/L ETDA ( pH 8.0 )：加 18.6 g 的 EDTA ( 二鈉二水合物形式）到 75 ml 的水中溶解 EDTA 并用 10 mol/L NaOH 將 pH 調至 8.0。加水至 100 ml。高壓滅菌后室溫保存。
(5) 10%（m/V）SDS，室溫保存。
(6) 50%（m/V）甘油，高壓滅菌后室溫保存。
(7) 1 mol/L MgCl2，高壓滅菌后室溫保存。
(8) 2 mol/L KCl，高壓滅菌后室溫保存。
(9) 1 mol/L HEPES 鉀鹽（HEPES-K+），23℃ 時 pH 為 7.8：加 119.2 g HEPES 和 20.1 g KOH 到 400 ml 的水中，加水至總體積 500 ml。稀釋一小份樣品到 10 mmol/L，檢測 23°C 時其 pH 是否為 7.5，必要時可用 2 mol/L HCl 調節 pH。在 4℃ 其 pH 應為 7.8。高壓滅菌或者過濾除菌后于 -20℃ 保存。溶液在高壓滅菌后可能有點發黃，但不影響使用。
(10) 1 mol/L DTT：DTT 固體儲存在 -20°C，該溶液保存于 4℃，應該在 24 h 內使用。
(11) 0.5 mol/L PMSF，-20℃ 保存。
(12) 1 mol/L 磷酸鉀緩沖液（pH 7.6）：慢慢將 8.85 g KH2PO4 和 75.75 g K2HPO4 加入到 400 ml 水中，溶解后，其 pH 應該是7.6，然后把總體積調到 500 ml 并高壓滅菌。室溫保存。
(13) 酶解酶溶液 ( zymdyase)：用 20 mmol/L 磷酸鉀、5% 葡萄糖的緩沖液配制 20 mg/ml ( pH 7.6 ) 的酶解酶溶液，用前配制。酶解酶-100T ( 100000 U/g ) 固體于 4°C 儲存。從 1 L 的細胞培養物中制備提取物需 10 mg 的酶解酶。酶解酶不能完全溶解，但不影響使用。
(14) 2 mol/L D-山梨醇：高壓滅菌，室溫保存。
(15) SB 緩沖液：1 mol/L 山梨醇，50 mmoI/L Tris-HCl ( pH 7.8），10 mmol/L MgCl2，室溫保存。加 1.5 ml 的 1 mol/L DTT 到 50 ml 的 SB 中以制備新鮮的 SB+30 mmol/L DTT。加 0.75 ml 的 1 mol/L DTT 到 250 ml 的 SB 中以制備新鮮的 SB+3 mmol/L DTT。
(16) 等滲液：1 mol/L 山梨醇，以水稀釋 2 mol/L 山梨醇至 1 mol/L。
(17) 裂解液：0.1%（m/V）SDS，50 mmol/L EDTA。
(18) 緩沖液 A：10 mmol/L HEPES-K+ ( pH 7.8 )，1.5 mmol/L MgCl2，20 mol/L KCl，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF。新鮮制備并置于冰上。加 1 ml 的 1 mol/L HEPES-K+ ( pH 7.8 )，150 μl 1 mol/L MgCl2，1 ml 2 mol/L KCl 和 50 μl 1 mol/L DTT 到97 ml 的滅菌水中，僅在使用前才加入 100 μl 0.5 mol/L PMSF。注意 PMSF 在水溶液中的半衰期大約為 30 min。加入 PMSF 時會產生少量沉淀但不影響使用。
(19) 緩沖液 D：20 mmol/L HEPES ( pH 7.8)，0.2 mmol/L EDTA，50 mmol/L KCl，20% 甘油( V/V )，1 mmol DTT，0.5 mmol/L PMSF，從 1 L 細胞培養物中制備提取物，須提前一天準備 2 L 的緩沖液 D。高壓滅菌，置冷室冷卻過夜。在透析前加 1 ml 1 mol/L DTT 和 1 ml 0.5 mol/L PMSF。
(20) AGK 緩沖液：10 mmol/L HEPES-K+ ( pH 7.8 )，1.5 mmol/L MgCl2，200 mmol/L KCl，10% （V/V）甘油，0.5 mmol/L DTT 和 0.5 mmol/L PMSF。使用前才加 PMSF。
2. 體外轉錄和剪接分析用溶液
(1) 10X TBE：890 mmol/L Tris-硼酸，25 mmol/L EDTA（pH 8.3）。室溫保存。
(2) 1X TBE：用蒸餾水或者去離子水稀釋 10XTBE 至 1XTBE，室溫儲存。
(3) 1XTE：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.6 )，1 mmol/L EDTA。室溫儲存。
(4) 30%（m/V）PEG8000，50℃ 加熱溶解，高壓滅菌，溶液冷卻后分裝為每份 1 ml 和 10 ml，于 -20℃ 儲存。
(5) 1 mol/L 亞精胺：1.27 g 三鹽酸亞精胺（spermidine trihydrochloride ) 溶于 3.5 ml 滅菌水中，用 10 mol/L NaOH 調整 pH 至 7.6，加水到 5 ml。-20℃ 保存。
(6) 10X 轉錄緩沖液：0.4 mol/L Tris-HCl（pH 7.8)，60 mmol/L MgCl2，40 mmol/L 亞精胺。500 μl 每份儲存于 -20℃。
(7) 0.1 mol/L DTT：用水稀釋 1 mol/L DTT 至 0.1 mol/L，500~750 μl 每份儲存于 -20℃。
(8) 10X NTP：ATP、GTP、CTP 各 5 mmol/L，UTP 1 mmol/L( pH 7.0)，儲存于 -20℃ 使用時 37℃ 水浴迅速解凍并放在冰上。
(9) 100 mmol/L ATP：儲存于 -20℃。使用時 37℃ 水浴迅速解凍并放在冰上。
(10) 二氯乙酸（TCA)：將 500 g TCA 加入 227 ml 的水中制備 100% TCA。在量筒中分別稀釋 10 或 20 倍以制備 10% 和 5% 的 TCA。
(11) 3 mol/L 乙酸鈉（NaAc) ( pH 5.4)：加 40.82 g 的二水乙酸鈉至 75 ml 水中，加冰乙酸調 pH 到 5.4，最后加水至 100 ml。高壓滅菌，室溫保存。
