酵母雙雜交技術，它是通過利用轉錄激活因子GAL4的特性而建立的。GAL4由兩個結構域組成，一個為N端的DNA結合域（DNAbinding domain，DBD），另一個是C端的轉錄激活域（active domain，AD），二者可以從核酸一級結構上分開而獨立表達出有功能的結構域；當二者在物理空間上靠近時可以表現出完整的轉錄因子的活性，和自然表達轉錄激活因子GAL4一樣，可結合其順式元件UASG并激活下游的半乳糖苷酶基因轉錄。因此，如果用目的蛋白A的核酸序列同DNA結合域的核酸序列融合表達表達DBD-A，用目的蛋白B的核酸序列同轉錄激活域的核酸序列融合表達AD-B, 如果A和B兩個蛋白能夠相互作用，則DNA結合域（DBD）和轉錄激活域（AD）在物理空間可以靠近，這時就能夠表現出完整的轉錄激活因子的功能，從而激活其下游基因的表達。因此，檢測GAL4調控的半乳糖苷酶的活性就可判斷A、B兩個蛋白是否可以相互作用。
就這么說吧，首先，你把目的基因構建到DNA結合質粒（BD質粒）中，并轉入到a型酵母（如Y187）中形成釣餌（Bait）；其次將全cDNA片段構建的轉錄激活質粒（AD質粒）轉化到b型酵母（如AH109）中，那么每個b型酵母含有一個隨機的AD質粒，就形成了酵母庫；最后將兩種菌共培養，就會發生異型細胞的融合使得AD和BD兩個質粒同時進入到一個酵母細胞中，當目的蛋白和酵母庫中AD質粒所表達的蛋白互作時，質粒上的氨基酸合成基因就會被啟動激活，使得酵母可以在營養缺陷型的培養基上生長了。
酵母雙雜文庫篩選步驟
（1）挑取轉有重組質粒的AH109單菌落接種于含5ml 2xYPDA液體的試管中，28℃ 220rpm 48h（菌液的濃度達到1ｘ109cell/mL）；
（2）從-70 ℃超低溫冰箱中取出Y187的cDNA文庫（細胞數達到2ｘ107cell/mL）在水中室溫解凍；
（3）把5 mL轉有誘餌基因的AH109菌液和1mL擬南芥cDNA文庫（Y87）合并在一個2L的錐形瓶中，并加入45 mL的2ｘYPAD，卡納終濃度50 μg/mL；
（4）用1 mL的2ｘYPAD溶液（卡納終濃度50 μg/mL）涮洗裝文庫的離心管，合并到一起
（5）在30 ℃搖床中40 rpm緩慢搖動20-24 h；
（6）20 h后，在400倍顯微鏡下觀察細胞，如果細胞融合的很好，則進行下一步實驗，否則繼續搖床中培養4 h；
（7）用1個滅菌的50 mL離心管收集菌液，另找一個離心管配平，1000 g離心10min，棄上清；
（8）用50 mL的0.5ｘYPDA溶液（卡納終濃度50 μg/mL）涮洗錐形瓶2次，把溶液混在一起，1000 g離心10 min，棄上清；
（9）用10 mL的0.5ｘYPDA溶液（卡納終濃度50 μg/mL）重懸菌體，涂布在SD/-Trp-Leu-His平板上（培養皿規格150 mm），每個皿200 μL；
（10）30℃培養箱中倒置培養。
（11）待菌落長出后，再轉移到SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上
（12）30℃培養箱中倒置培養。
主要應用：
（1）發現新的蛋白質和蛋白質的新功能；也可作為研究已知基因的新功能或多個篩選到的已知基因之間功能相關；
（2）在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用；
（3）篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質之間相互的影響；
（4）分析新基因的生物學功能。
（5）檢驗一對功能已知蛋白間的相互作用，研究一對蛋白間發生相互作用所必需的結構域。
（6）用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫，以研究蛋白質之間相互作用的傳遞途徑。
（7）建立基因組蛋白連鎖圖。