一．質粒酶切及線性化
1）用維特潔日常型小量DNA純化試劑盒抽提9KSF2，可得到較純的質粒10μg/3ml菌液，終體積80ul。
2）線性化質粒
使用80μl酶切體系
9KSF2質粒 70μl
內切酶（SacI， SalI， BglⅡ） 2μl
10 x buffer 8μl
3）酶切3－16小時，一般3小時即可；
二．乙醇回收酶切質粒
1）2倍體積無水乙醇和0.1倍體積的3M NaAC（PH 5.2），混勻，沉淀DNA；
2）－200C數個小時（>2小時），13,200rpm離心10～20分鐘，吸棄上清；
3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm離心10分鐘，吸棄上清（注意離心管位置，從含有DNA的離心管另一側吸取）；
4）37℃烘干水分和殘留乙醇；
5）用20μl ddH2O重溶；
6）1ul樣品電泳檢測DNA量，計算DNA總量；
三．電轉化
1．準備感受態細胞
1）5ml YPD 接種GS115單菌落，250rpm，300C，搖菌24 hours；
2）100ml YPD，接種百分之一，同時留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5；
3）菌液轉入500ml離心管，JA14，1500g，40C離心5 min，棄上清；
4）100ml冰水重懸，同上離心，棄上清；
5）80～90ml冰水重懸【50ml】，同上離心，棄上清；
6）20ml冰1M sorbitol 重懸【5ml】，然后轉移到50ml 離心管中，同上離心，棄上清；
7）約150μl 1M sorbitol重懸【250ul】，40C備用，剩下的感受態細胞可以保存在－700C 冰箱大約3周。
2．轉化
1)100μl GS115感受態細胞加入＋20μl 線性化質粒，用槍打勻；
2)冰浴5min，加入0.2cm轉化杯中，輕輕將液體震到杯底，立即冰浴；
3) 電轉化，參數設定：電壓 1500V 電容 25μF 電阻 200歐姆，放電時間 4～5ms
4)立即加650μl 冰 1M sorbitol 入轉化杯，打勻；
5) 迅速涂板，250μl/塊 MD板，共3塊； 6)涂好的板放在300C培養箱中培養4～5天，至菌落直徑1mm即可。 注：
a）【】內為手冊推薦量，相關文獻報道，轉化效率一般為103～104 / ugDNA，所需質粒量0.3－10ug不等；
b）放電是可好出現電擊穿現象，原因有：酵母濃度不夠；DNA溶液離子濃度過大；混合液體積不夠；
c）MD板加入1M sorbitol ，轉化時第2）步冰浴時間延長至1－2小時，均有利于提高轉化效率
四．G418篩選多拷貝基因
1）取出長有克隆的3塊板，可考慮先挑10－20個菌落先表達；
2）第一塊加入2ml 滅菌的ddH2o，用涂布棒打勻，洗后，菌液吸入第二塊；
3）第二塊加入1ml，洗之，吸入第三塊；
4）菌液吸入EP管，可適量補充ddH2o；
5）混勻后取適量稀釋約50倍，4ul×50＝200ul每塊G418板，G418濃度從0.25－4.0mg/ml各一塊；
6）注意涂布均勻，可適量補充ddH2o，
7）300C烘箱培養，2－5day，其余菌液可40C保存
注：
a）手冊推薦方法：第4）步將菌液轉入EP管中，振蕩5－10秒，用分光光度計測菌體密度，1OD600＝5×107 cells/ml, 取一定體積稀釋至200ul/每塊G418板, 涂布～105 cells；注意agar的存在會干擾分光光度計的讀數。
五．表達：
1）從G418板挑單克隆入4ml/管MGY接種，300C，250rpm，2天左右至OD＝2－6，顏色乳白；
2）取1ml菌液于EP管中保種，余3ml菌液離心，1500g，5min，菌體換3ml BMMY，加千分之五甲醇，300ul/管；
3）每隔24小時加千分之五甲醇；
4）至表達之日起2天后每天取樣80ul，留作電泳分析；
5）表達4天結束，1500g離心，5min，分別收集上清和沉淀；
6）上清用作蛋白分析，跑SDS-PAGE電泳，Western Blotting分析，ELISA分析，樣品濃縮，純化分析等