一、酶促反應
1913年，Michaelis和Menten根據Henri等提出的酶-底物復合物學說，用簡單的快速平衡或準平衡概念推導了單底物的酶促反應方程，即米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation）。酶促反應可表示為：
k1 k2
E + S ------------- ES -------- E + P
k-1
酶 底物 酶-底物復合物 酶 產物
根據公式進行推導，反應速率（V0或v）與底物濃度[S]、酶濃度[E]和產物濃度[P]的關系如下：
式中Vmax為最大反應速率。這一公式與根據快速平衡學說推導的米-曼氏原始方程形式相同，區別在于用米氏常數Km取代了復合物ES的解離常數Ks，因此仍稱為米-曼氏方程。
二、Km與Vmax
（一）Km
若v=0.5Vmax，則Km=[S]，可見Km值等于酶促反應的初速率為最大速率Vmax一半時的底物濃度。Km值一般在10-6～10-2mol/L之間。Km只與酶的性質有關，而與酶的濃度無關。
Km是酶的特征性常數之一，在臨床酶學分析中有重要意義。
1. 1/Km可近似地表示酶對底物的親和力的大小，Km值越小，表示酶與底物的親和力越大，反之亦然。
2. 如果一個酶有幾種底物，則對每一種底物各有一個特定的 Km值，其中Km值最小的底物大都是該酶的最適底物或天然底物。
3.如已知酶的Km，可計算某一底物濃度時反應速率v和最大速率Vmax的比值，并可推知酶的活性中心被底物飽和的分數。同樣，如要求v和Vmax有一定的百分比，也可算出所需底物濃度為其Km的多少倍。
4.利用工具酶來測定體液中某一成分的濃度或某一酶的催化活性濃度時，可根據米-曼氏方程或其衍變方程式來計算工具酶的用量。
5.測定Km值可鑒別不同來源但催化相同反應的酶是同一種酶或是同工酶。
6.如一個酶催化正逆兩個方向，測定正逆兩個方向底物的Km及底物濃度，可大體推測該酶在體內催化反應的方向及其催化效率。
7.在代謝酶系中，當一組酶催化連續的代謝反應時，如已知各酶的Km及其相應底物的濃度，有助于尋找代謝的限速步驟。一般Km值最大的酶所催化的反應為該酶系的限速步驟。
（二）Vmax
Vmax表示在一定酶量下的最大反應速率，即酶完全被底物飽和時的反應速度，與酶濃度呈正比。在酶的濃度不變時，對于特定底物而言，Vmax也是一個常數。
如果酶的總濃度已知，可從Vmax計算酶的催化常數，即轉換數Kcat。計算公式為Vmax=Kcat[E0]。Kcat表示單位時間內每個酶分子將底物分子轉換成產物的最大值。Kcat越大，表示酶的催化效率越高。對于多數酶而言，Kcat在每1 s-1～104 s-1范圍內。Kcat/Km比值不僅可用來衡量酶對底物的專一性，還可用于檢驗酶催化反應是否達到恒態或平衡態。
（三）Km和Vmax的測定
將米-曼氏方程經過演變而轉換成直線方程，然后根據直線的斜率及用外推法或用計算機以最小二乘法處理實驗數據即可得到Km和Vmax。其中以Lineweaver-Burk雙倒數作圖最常用。
將米-曼氏方程進行倒數處理，得下列方程：
以1/V0為縱坐標，1/[S]為橫坐標作圖可得一直線。縱軸截距為1/Vmax，斜率為Km/Vmax，橫軸截距為-1/Km。
Lineweaver-Burk雙倒數作圖除用于求取Km和Vmax外，還可用于判斷可逆性抑制反應的性質。此外還有Woolf作圖、Eadie-Hofstee作圖和Hanes作圖等，實際應用較少。
三、酶促反應的影響因素及反應條件的選擇
影響酶促反應的因素主要有酶濃度、底物濃度、pH、溫度、電解質及輔酶、激活劑及抑制劑等。
（一）酶濃度
在底物濃度遠大于酶濃度時，酶促反應隨酶濃度的增加而增加，即反應速率與酶的濃度成正比。在病理情況下，酶濃度過高時，底物過早而且過多地被消耗，影響酶活性測定，故需用生理鹽水或其他緩沖液進行適當的稀釋。但要注意稀釋對測定結果的影響，如低酶濃度時，酶易解離為單體，常比多聚體更易失活。
（二）底物的種類和濃度
有些酶專一性不強，可作用多種底物，則須根據需要選擇合適的底物。研究酶的生理作用時，一般選擇Km最小的最適底物。臨床酶學測定時，應首先考慮有較高診斷價值的底物。底物專一性強的酶，如其所催化的為可逆反應，則和專一性不強的酶一樣，需要從測定技術和實用方面考慮選擇速度較快的正向或負向反應。
根據米-曼氏方程，當底物濃度[S]>>Km時，則反應速率v=Vmax=K2[E]，即反應速率與酶濃度[E]成正比，此為零級反應。在此種條件下，酶均能與足夠的底物進行反應。因此，臨床酶學測定時應給予充分的底物濃度。在一定酶量下（Vmax），反應速率視底物濃度[S]而定。當[S]<<Km時，v=Vmax[S]/Km =K[S]，呈一級反應，這是臨床化學利用酶作為工具測定各種代謝物如葡萄糖、尿酸、膽固醇等濃度的方法學基礎。如[S]既不遠小于又不遠大于Km時，米-曼氏方程就代表一種混合級反應的方程式。根據米-曼氏方程，一般酶測定時底物濃度最好為Km的10～20倍。實際工作中應根據具體測定酶的底物類型和反應特性進行選擇。
上述米-曼氏方程只適用于單一底物的酶促反應，不少酶促反應中有兩種或兩種以上的底物參加反應。雙底物反應的可能機制有有序順序、隨機順序和乒乓機制三種，有關雙底物酶促反應的米-曼氏方程和底物濃度選擇可參考有關書籍。譬如，可先將其中的一種酶的底物濃度選得很高，使酶飽和，然后求出另一底物的表觀Km，反之亦然，最后按上述規律決定兩底物的濃度。
（三）緩沖液的種類、離子強度和pH
酶與底物結合的能力，酶的催化活性，會受不同pH的影響，只有在最佳緩沖系統內才能充分表達。各種酶都具有使酶促反應速率最大時的pH，即最適pH。一般來說，植物和微生物酶的最適pH多在4.5～6.5左右，動物酶多在6.5～8.0之間。如ACP反應的最適pH為4.0～7.0，而ALP則為9.0～10.0。
最適pH并非酶的特征性常數，易受緩沖液的種類、離子強度及底物濃度不同等因素影響。臨床酶學測定時發現，用不同種類的緩沖液配制相同pH介質所測酶活性并不相同。緩沖液的離子強度也可影響酶的活性。必須強調的是，各種體液樣品本身也是緩沖液，和底物混合后不一定維持原來pH，也會影響酶活性測定結果，所以應嚴格掌握測定樣品與底物的用量比例，一般樣品在總體積中的比例應不超過10%。此外，緩沖液中的物質不應與分析系統中的任何物質反應，否則應特別加以說明。
（四）溫度
酶促反應也有一個最適溫度，在其兩側反應速率都比較低。在達到最適溫度以前，溫度每增加10℃，反應速率增加1～2倍。但溫度對酶活性的影響具有雙重性，一方面溫度升高可加快酶促反應，酶的Q10值約為1.5～2.5（Q10值為溫度增加10℃，化學反應的變化率）；而另一方面溫度可能使酶失活。一般動物酶的最適溫度為35～40℃，植物酶為40～60℃，少數嗜熱性細菌所含的酶，其最適溫度可達90～100℃。人體大多數酶的最適溫度為37℃左右，超過42℃酶活性就逐漸降低，至60℃時酶因蛋白變性而失去活性。反之，酶在20℃以下時幾乎無催化反應。酶的最適溫度與底物濃度、pH、離子強度、保溫時間等許多因素有關。
測定酶活性的溫度長期未統一，依不同學會推薦大致有3種溫度，如25℃，30℃和37℃。我國推薦溫度為37℃。近來IFCC也將酶測定溫度改為37℃。測定酶活性時，為保證測定結果的準確性，所用溫度的誤差不能大于±0.1℃。不同溫度測定酶活性結果之間，一般不推薦使用酶的溫度校正系數（或稱溫度轉換系數）。此外，酶制劑應保存在冰箱中，取出后應恢復至室溫立即應用，以免發生變性。
（五）激活劑與抑制劑
臨床酶學測定中廣泛地應用金屬離子等激活劑來提高測定的靈敏度。例如所有轉磷酸的酶，如激酶類和ALP的反應都需要Mg2+的參加，如在反應體系中加入EDTA等螯合劑或以其為抗凝劑常抑制一些酶的活性。測定CK活性時，加入的激活劑有Mg2+ 和巰基，其中Mg2+是CK的輔基，含巰基的N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）使CK活化。
抑制劑所產生的抑制作用分為不可逆性與可逆性兩類。前者抑制劑與酶共價結合，使酶活性喪失。此類抑制劑多為非生物源性物質。后者抑制劑通過非共價鍵與酶可逆性結合。可逆性抑制又分為競爭性、反競爭性、非競爭性抑制和混合性抑制。它們之間的差別在于抑制劑與酶的結合方式不同，從而對酶促反應動力學參數Km和Vmax的影響作用不同（表6-2）。在設計和選擇酶測定的方法時，應設法避免抑制劑對酶促反應的影響。如進行尿酶測定時，一般可先通過透析、凝膠色譜或超濾等方法將尿中一些小分子抑制劑與酶分開，以使測定結果更為可靠。
表6-2 各種可逆性抑制與Km及Vmax的關系
|
抑制類型 Km |
Vmax |
|
競爭性抑制 增大 反競爭性抑制 減小 非競爭性抑制 不變 混合性抑制 增大或減小 |
不變 減小 減小 減小 |
（六）其他
采用酶偶聯法測定酶活性時，反應體系必須加入指示酶，有些方法還需加入輔酶。此外，反應時間及產物對酶促反應也有影響。man'; mso-hansi-font-family: 'Times New Roman'">，少數嗜熱性細菌所含的酶，其最適溫度可達90～100℃。人體大多數酶的最適溫度為37℃左右，超過42℃酶活性就逐漸降低，至60℃時酶因蛋白變性而失去活性。反之，酶在20℃以下時幾乎無催化反應。酶的最適溫度與底物濃度、pH、離子強度、保溫時間等許多因素有關。
測定酶活性的溫度長期未統一，依不同學會推薦大致有3種溫度，如25℃，30℃和37℃。我國推薦溫度為37℃。近來IFCC也將酶測定溫度改為37℃。測定酶活性時，為保證測定結果的準確性，所用溫度的誤差不能大于±0.1℃。不同溫度測定酶活性結果之間，一般不推薦使用酶的溫度校正系數（或稱溫度轉換系數）。此外，酶制劑應保存在冰箱中，取出后應恢復至室溫立即應用，以免發生變性。
（五）激活劑與抑制劑
臨床酶學測定中廣泛地應用金屬離子等激活劑來提高測定的靈敏度。例如所有轉磷酸的酶，如激酶類和ALP的反應都需要Mg2+的參加，如在反應體系中加入EDTA等螯合劑或以其為抗凝劑常抑制一些酶的活性。測定CK活性時，加入的激活劑有Mg2+ 和巰基，其中Mg2+是CK的輔基，含巰基的N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）使CK活化。
抑制劑所產生的抑制作用分為不可逆性與可逆性兩類。前者抑制劑與酶共價結合，使酶活性喪失。此類抑制劑多為非生物源性物質。后者抑制劑通過非共價鍵與酶可逆性結合。可逆性抑制又分為競爭性、反競爭性、非競爭性抑制和混合性抑制。它們之間的差別在于抑制劑與酶的結合方式不同，從而對酶促反應動力學參數Km和Vmax的影響作用不同（表6-2）。在設計和選擇酶測定的方法時，應設法避免抑制劑對酶促反應的影響。如進行尿酶測定時，一般可先通過透析、凝膠色譜或超濾等方法將尿中一些小分子抑制劑與酶分開，以使測定結果更為可靠。
表6-2 各種可逆性抑制與Km及Vmax的關系
|
抑制類型 Km |
Vmax |
|
競爭性抑制 增大 反競爭性抑制 減小 非競爭性抑制 不變 混合性抑制 增大或減小 |
不變 減小 減小 減小 |
（六）其他
采用酶偶聯法測定酶活性時，反應體系必須加入指示酶，有些方法還需加入輔酶。此外，反應時間及產物對酶促反應也有影響。