酶標儀實際上就是一臺變相光電比色計或分光光度計，其基本工作原理與主要結構和光電比色計基本相同。一種單通道自動進樣的酶標儀工作原理：光源燈發出的光波經過濾光片或單色器變成一束單色光，進入塑料微孔極中的待測標本。該單色光一部分被標本吸收，另一部分則透過標本照射到光電檢測器上，光電檢測器將這一待測標本不同而強弱不同的光信號轉換成相應的電信號。電信號經前置放大，對數放大，模數轉換等信號處理后送入微處理器進行數據處理和計算，最后由顯示器和打印機顯示結果。 微處理機還通過控制電路控制機械驅動機構X方向和Y方向的運動來移動微孔板，從而實現自動進樣檢測過程。而另一些酶標儀則是采用手工移動微孔板進行檢測，因此省去了X,Y方向的機械驅動機構和控制電路，從而使儀器更小巧，結構也更簡單。
酶標儀可簡單地分為半自動和全自動2大類。
酶標儀從原理上可以分為光柵型酶標儀和濾光片型酶標儀。光柵型酶標儀可以截取光源波長范圍內的任意波長，而濾光片型酶標儀則根據選配的濾光片，只能截取特定波長進行檢測。