酶活性的測定實驗

1.酶的量或濃度可以用摩爾量表示，或者用酶單位的活性表示。

酶活力=每單位時間轉化的底物摩爾數=速率×反應體積。酶活性是存在的活性酶量的量度，取決于指定的條件。SI單位是katal，1 katal = 1 mol /s，更實際的和常用的值是酶單位（U）= 1μmol/min。1 U對應16.67 nanokatals。

酶的比活力是另一種常見的單位，代表酶的純度。用每毫克蛋白質所含的酶活力單位數來表示。比活力=活力U/mg蛋白。

反應的速率是每單位時間的底物消失（或產物生成）的濃度。

如果已知100％純酶的比活性，那么不純的樣品將具有較低的比活性，從而可以計算純度。

2.為了檢測一種酶的催化活性，有必要首先鑒定從底物 （S） 到產物 （P） 轉化所包含的化學變化。迄今為止，在各種關于酶催化活性文章的相關論述中，最典型的分類方式是按照其所催化的化學反應的類型來進行的 （如氧化-還原、基團轉移、消除、異構化、重排、縮合、竣化作用等）（FreyandHegeman，2007）。此外，還應該考慮是否存在機制相似的化學過程：①涉及小分子底物或大分子蛋白質或核酸;②在溶液中易于發生或需要膜結合組分才能進行;③逆反應進行到多大的程度。在任何情況下，酶的分析圍繞著以可計量的方式將給定底物和相關產物的理化性質進行區分的能力來設計 （EisenthaUndDans0n,2002;Rossomando,1990）。在很大程度上，類似的活性檢測方法已經應用于這些亞群中的各種酶。在以某種已有檢測方法為基礎來為下面兩類酶首次設計檢測方法時要慎重，即不同物種來源的同源酶或催化相關化學反應的不同的酶。酶活性檢測的中心主題是確保初始速率的測定。為了重申這一要點，常見的和較好的做法是， 在具有小于等于 5% 產物轉化的時間內測定反應物減少或產物生成的初始速率。這種做法可以給出在初始底物濃度條件下的最接近起始反應速率的值。

酶樣品底物

對硝基苯磷酸鹽二乙酸酯（FDA）MTT

分光光度計熒光光度計量熱計HPLC

連續測定是最方便的，一種測定給出反應速率，無需進一步的工作。有許多不同類型的連續測定。

1.分光光度法

在分光光度測定中，您可以通過測量測定溶液吸收的光量變化來跟蹤反應過程。如果這種光在可見區域，您實際上可以看到測定顏色的變化，這稱為比色測定。MTT測定，使用四唑染料作為底物的氧化還原測定法是比色測定法的一個例子。

通常使用UV光，因為常見的輔酶NADH和NADPH以其還原形式吸收UV光，但不以其氧化形式吸收。因此，使用NADH作為底物的氧化還原酶可以通過在消耗輔酶的情況下在340nm波長下的UV吸光度的降低來測定。[4]

2.直接偶聯測定

使用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯測定己糖激酶。

即使當酶反應不會導致光的吸光度發生變化時，仍然可以通過使用偶聯測定法對酶進行分光光度測定。這里，一次反應的產物用作另一種易于檢測的反應的底物。

3.熒光

熒光是指分子在吸收不同波長的光后發出一種波長的光。熒光測定使用來自產物的底物熒光的差異來測量酶反應。這些測定通常比分光光度測定更靈敏，但是可能遭受雜質引起的干擾以及當暴露于光時許多熒光化合物的不穩定性。

這些測定的一個例子是核苷酸輔酶NADH和NADPH的使用。這里，還原形式是熒光的，氧化形式是非熒光的。因此，氧化反應之后可以通過增加來減少熒光和還原反應。也可獲得在酶催化反應中釋放熒光染料的合成底物，例如用于測定β-半乳糖苷酶的4-甲基傘形基-β-D-半乳糖苷。

4.量熱

量熱法是測量化學反應釋放或吸收的熱量。這些測定非常通用，因為許多反應涉及一些熱變化并且使用微量熱計，不需要太多的酶或底物。這些測定可用于測量不可能以任何其他方式進行測定的反應。

5.化學發光

化學發光是通過化學反應發光。一些酶反應產生光，這可以測量以檢測產物形成。這些類型的測定可以是非常敏感的，因為產生的光可以在數天或數周內被照相膠片捕獲，但是可能難以量化，因為不會檢測到反應釋放的所有光。

通過酶化學發光（ECL）檢測辣根過氧化物酶是在蛋白質印跡中檢測抗體的常用方法。另一個例子是酶螢光素酶，這種螢光素酶存在于螢火蟲中并且自然地從其底物熒光素產生光。

6.光散射

靜態光散射測量重均摩爾質量和溶液中大分子濃度的乘積。給定在測量時間內一種或多種物質的固定總濃度，散射信號是溶液的重均摩爾質量的直接量度，其隨著絡合物形成或離解而變化。因此，測量量化了復合物的化學計量以及動力學。蛋白質動力學的光散射測定是非常通用的技術，其不需要酶。

7.微尺度熱泳

微尺度熱泳（MST）測量平衡時分子/底物的大小，電荷和水合熵。熒光標記的底物的熱泳運動在被酶修飾時發生顯著變化。可以以高時間分辨率實時測量該酶活性。]全光學MST方法的材料消耗非常低，僅需要5μl樣品體積和10nM酶濃度來測量活性和抑制的酶速率常數。MST允許分析人員一次測量兩種不同基板的修改（多路復用））如果兩種底物都用不同的熒光團標記。因此可以進行基質競爭實驗。

測定中可能影響的因素：

1.鹽濃度：大多數酶不能耐受極高的鹽濃度。離子干擾弱離子鍵的蛋白質。典型的酶在1-500mM的鹽濃度下具有活性。例如嗜鹽 藻類和細菌。

溫度的影響：所有酶都在生物體特有的溫度范圍內起作用。溫度升高通常會導致反應速率增加。較高的溫度會導致反應速率急劇下降。這是由于弱離子和氫鍵的分解導致的穩定了酶活性位點的三維結構的蛋白質結構的變性（改變）。人體酶的“最佳”溫度通常在35到40°C之間。人類的平均溫度是37°C。人體酶在高于40°C的溫度下開始迅速變性。來自嗜熱的酶 在溫泉中發現的古菌在高達100°C時穩定。酶反應的“最佳”速率的想法是不合理的，因為在任何溫度下觀察到的速率是兩種速率，反應速率和變性速率的乘積。

2.pH的影響：大多數酶對pH敏感并且具有特定的活性范圍。都具有最佳pH值。pH可以通過破壞離子鍵和氫鍵使酶的三維形狀變性（改變）來阻止酶活性。大多數酶的pH值在6到8之間; 然而，胃中的胃蛋白酶在pH值為2時效果最好，胰蛋白酶在pH值為8時效果最佳。

3.底物飽和度：增加底物濃度可提高反應速率（酶活性）。然而，酶飽和度限制了反應速率。當大多數時間所有分子的活性位點都被占據時，酶就會飽和。在飽和點，無論添加多少額外的底物，反應都不會加速。反應速率圖將趨于穩定。

4.大分子擁擠的效應，溶液中的大量大分子的擁擠程度將改變酶反應的速率和平衡常數

常見的與酶測定有關的測定方法：

1.熒光素二乙酸酯（FDA）水解測定。

2.對硝基苯磷酸鹽可介導 ELISA和常規分光光度測定。

3.MTT測定。