酶測定法實驗

核心 RNA 聚合酶 純σ32 標準品 純化的 σ32 樣品 核心 RNA 聚合酶-σ32 復合物樣品 [α-32P]UTP 終止液 DEAE-纖維素（DE81) 紙片 P04 清洗緩沖液 乙醇 反應液

水浴鍋

材料與設備

核心 RNA 聚合酶 (2.3 mg/ml)

純σ³² 標準品 (0.8 mg/ml)

純化的 σ³² 樣品，由 POROS 50S 陽離子交換柱洗脫所得

核心 RNA 聚合酶-σ³² 復合物樣品，由免疫親和柱洗脫所得

[α-³²P]UTP（ 用 2.5uCi/ml 的反應液)

水浴，設定 37°C

終止液 (0.2mol/LEDTA)

DEAE-纖維素（DE81) 紙片

P04 清洗緩沖液（5%Na2 HP04)

乙醇（95%)

試劑

反應液

(配方，見“試劑的配制”，PP.184~189)

搡作程序

1) 用吸管取 50-ul 等分反應液（含 2.5uCi[α-³²P]UTP/ml) 加入置于冰上的各試管。

2) 各加入 5ul 適當稀釋的σ32 樣品，混勻。一個樣品應是標準制備物, 另一個樣品應是由免疫親和柱洗脫所得的核心 RNA 聚合酶-σ³² 復合物。還應確保有一個“不含σ³²”的空白對照以測定只有核心 RNA 聚合酶的摻入量，及一個“未孵育”的空白對照（加終止液于置冰上的試管, 但不在 37°C 孵育) 以測定本底。

3) 除含核心 RNA 聚合酶-σ³² 復合物的各管和含純σ32 標準的一管外，其佘各管均加 5ul 稀釋的核心 RNA 聚合酶（總量 1ug)。

4) 各管 37°C 孵育 10 min 后，加 10ul 終止液終止反應。

5) 取各管反應液 25ul, 分別點在 DEAE-纖維素紙片上。

6) 將紙片放入燒杯，用預冷的 P04 清洗緩沖液洗 4 次，每次 100 ml 洗 5 min。前兩次的清洗液倒入放射性廢液容器。最后，分別用只 H₂0 和 95% 乙醇各洗一次。

7) 干燥紙片，進行放射性計數。

8) 對每個σ³² 樣品，取摻入量（已減去“未孵育”空白對照的本底對其加樣量作圖。確定每個樣品相對于已知σ³² 標準的活性。裉據每個樣品的蛋白濃度，即可計算出相對比活性。
注：的另一活性是它與核心 RNA 聚合酶的結合能力。對此，可用非變性凝膠電泳分析核心 RNA 聚合酶轉化為核心 RNA 聚合酶-σ³² 復合物的情況來測定，如本單元實驗 5 所述（PP.169~171)。