酶類消毒劑的應用進展

消毒方法分為物理方法、化學方法及生物方法，用生物酶作為消毒劑應屬于生物消毒法之一。生物消毒是利用動物、植物、微生物和（或）其代謝產物消除或殺滅環境中致病微生物，從而達到控制疾病發生和傳播的目的〔1〕，生物消毒劑是指具有體外殺菌作用的生物制品。根據生物消毒劑的性質及來源，目前主要分為：①植物源消毒劑〔2,3〕：高等植物中抗菌的有效成分主要為香精油，香精油是酯、醛、酮和萜烯的化合物，萜類、生物堿類、黃酮類、甾體類、有機酸、蛋白質等也具有抗菌作用。②抗菌肽：生物體經誘導產生的一種具有抗菌活性的小分子多肽，目前從生物體中分離獲得的抗菌肽已超過1000種。隨著多肽化學合成技術的日趨成熟，國際上已有多條人工合成抗菌肽進入臨床研究〔4〕。③噬菌體：噬菌體可以專一感染某種細菌，鉆入細菌細胞并復制自己〔5〕，同事產生裂解酶，高度專一、快速裂解細菌細胞壁，殺死細菌并釋放出新生的病毒。④生物酶：生物酶廣泛存在于高等動物、原生動物、昆蟲、植物和各種微生物中，是一種高效、高度專一、具備生物酶性質的生物催化劑，在作用過程中一般本身不消耗。隨著近代生命科學與生物技術的迅速發展，將不同的酶類消毒劑進行復配，組合成復合生物酶消毒劑，可克服酶類消毒劑消毒譜單一的缺點。酶類消毒劑因具有高效、安全和理論上可反復使用的優點越來越受到關注。本文就酶類物質作為消毒劑的研究和應用進展進行綜述。

1 酶類消毒劑種類

1.1 幾丁質酶

幾丁質酶是由N–乙酰葡萄糖胺以β–1，4鍵連接而成的線性多糖，是大部分細菌細胞壁的結構物質。染病植株產生的幾丁質酶可破壞細菌細胞壁的幾丁質〔6〕。目前國內外對于幾丁質酶的研究主要為其抗菌機理，尚無相關應用研究。

1.2 過氧化物酶

已知對病原微生物有較好殺菌效果的過氧化物酶有鹵素過氧化物酶、乳過氧化物酶（LPO）和葡萄糖氧化物酶等。Hansen等報道了使用彎孢菌鹵素過氧化物酶可快速殺滅細菌、酵母和絲狀真菌〔7〕，H2O2的使用量為單獨使用時的1%左右，大大降低了H2O2的副作用，Johansen等〔8〕模擬醫療器械表面，制作菌膜生物模型，葡萄糖氧化酶和乳酸過氧化酶可殺死生物膜上的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、轉糖鏈球菌等，同時復合物明顯殺菌活性但可去除表面均膜的多糖水解酶，顯示出既可殺菌又可去除生物膜的效果。目前，國內外對于過氧化物酶的研究仍處于實驗時階段，尚無產品應用。

1.3 核酶

核酶（Ribozymes,RNA enzymes）是具有酶活性的一段RNA，具有高特異性和無毒性的特點，是近年來抗病毒研究熱點之一。核酶抗病毒作用目前多處于實驗研究階段，Sarver等將核酶英勇到抗HIV感染的研究中〔9〕，Weizsaker等研究串聯核酶體外抗乙肝病毒的效果〔10〕，核酶抗病毒的治療已顯露希望的曙光，但國內外尚無將核酶作為消毒劑應用的研究。

1.4 噬菌體裂解酶

噬菌體裂解酶（bacteriphage lysins）是由噬菌體編碼的在基因組復制晚期合成的一類蛋白質，它能夠水解細菌細胞壁的肽聚糖從而殺滅細菌。研究表明噬菌體裂解酶對肺炎鏈球菌、炭疽桿菌、乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌都有很好的殺菌作用〔11-17〕。噬菌體裂解酶還處于實驗室研究和臨床實驗階段。美國的洛克菲勒大學的Nelson等〔18〕是全球對噬菌體裂解酶研究最深入的一個小組。他們利用直接提取和基因克隆表達等方法分離純化出各類噬菌體裂解酶，并將切用于疾病的預防和治療。Fischetti〔19〕利用牙膏、漱口液、吸入劑、鼻噴霧。氣溶膠、眼藥水、含片、粉末、糖果、糖漿、口香糖、粉末、錠劑、栓劑、片劑、局部霜劑、繃帶、棉塞等作為載體，處理上呼吸道感染、皮膚感染、創傷、燒傷、陰道感染、眼感染、腸道疾病盒牙齒問題，并且還將噬菌體裂解酶制成針劑進行肌肉、皮下或靜脈注射。國內對噬菌體裂解酶還處于實驗室研究階段，未見有應用方面的報道。

1.5 溶菌酶

溶菌酶（lysozyme）又稱胞壁質酶（muramidase）或N–乙酰胞壁質聚糖水解酶（N–acetylmuramidegycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。廣泛存在于人體多種組織、鳥類和家禽的蛋清、哺乳動物的淚、唾液、血漿、乳汁等體液中，其中以蛋清含量最為豐富。

從雞蛋清中提取分離的溶菌酶是由18中129個氨基酸殘基構成，分子量為14000～15000dt的單一肽鏈。富含堿性氨基酸，有4對二硫鍵維持酶構型，是一種堿性蛋白質，其N端為賴氨酸，C端為亮氨酸。抗菌譜較廣，不僅可分解溶壁微球菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌等革蘭陽性菌，對部分革蘭陰性菌也有抑制效果。

溶解酶能有效地水解細菌細胞壁的肽聚糖，其水解位點是N–乙酰細胞壁酸（NAM）的1位碳原子間的β-1,4糖苷鍵。肽聚糖是細菌細胞壁的主要成分，對于革蘭陽性菌與革蘭陰性菌細胞壁中肽聚糖含量不同，革蘭陽性菌細胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，而革蘭陰性菌只有內壁層為肽聚糖，因此，溶菌酶破壞革蘭陽性菌細胞壁較革蘭陰性菌強。

溶菌酶有較強的抗熱性，最適pH6.5，酸性介質中可穩定存在；碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性劑（SDS、醇類、碳鏈不少于12的脂肪酸）對其有抑制作用；不會因為有機溶劑的處理而失活，當轉移到水溶液中時，溶菌酶的活力可全部恢復。

1.6 細菌素和細菌自溶素

細菌素和細菌自溶素是細菌自身分泌的蛋白酶類物質，用于拮抗同種或異種細菌，或者參與細菌自身重要的生理活動，如細菌繁殖，細胞分裂，孢子形成等〔20〕 。溶葡萄球軍最初由Schindler和Schu-hardt〔21〕從Staphylococcus simulans biovar staphylolyti-cus的培養物中發現，是目前國內外研究較為成熟的細菌素。該酶基因重組后在大腸桿菌或枯草桿菌中得到克隆表達〔22〕。基因重組溶葡萄菌酶為單鏈分子，分子量約為27KD，由近250個氨基酸組成，等電點pH10.5～11.0，基因的核酸組成有近1500個核苷酸。

溶葡萄球菌酶可裂解葡萄球菌細胞壁肽聚糖中的Gly-Gly鍵〔23〕，使細胞壁溶解而致微生物死亡。溶葡萄球菌酶只是針對細胞壁具有這種結構的細菌，所以只能裂解革蘭陽性細菌細胞壁，使其死亡。

溶葡萄球菌酶最適溫度37℃，超過55℃酶活力迅速下降；酶作用的最適pH為8～10，堿性環境中殺菌作用較強，酸性環境中殺菌作用減弱；EDTA、DDT、PMSF、PCMB對其無顯著影響，Ba2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+能不同程度地抑制溶葡萄球菌酶活性，而Zn2+則能有小的活性效應，可能和該酶是含鋅蛋白有關，除SDS能使酶失效外，Tween80、甘油、乙醇等其他表面活                                                                                      性劑（增溶劑）均有利于酶的作用。

1.7 復合溶葡萄菌酶

溶葡萄菌酶和溶菌酶裂解病原微生物均是針對細胞壁肽聚糖，但作用位點有所不同（圖1）。為拓寬酶類消毒劑的殺菌譜、提高酶類消毒劑的抗菌能力，可將其進行復配，制成以溶葡萄球菌酶和溶菌酶為主要成分的復合溶菌酶消毒劑〔24〕。Cisani等〔25〕研究發現復配后的溶葡萄球菌酶與溶菌酶具有協同殺菌作用，復配后的酶對不同病原菌的抑菌效果提高了16到200倍。

國內90年代初開始有復合溶菌酶消毒劑研究，復合溶菌酶在實驗和應用研究中都取得重要突破，復合溶菌酶產品已經應用于臨床消毒與治療〔2〕。

2  酶類消毒劑的應用

國內外酶類消毒劑的應用研究主要集中在以溶葡萄球菌酶和溶菌酶為主要成分的復合溶菌酶在消毒領域的應用。復合溶菌酶消毒劑由于無毒性，無刺激性以及不易產生耐藥性的獨特殺菌機理，廣泛應用于外科、燒傷創傷科、婦產科、口腔科、皮膚科和耳鼻喉科等的沖洗、消毒和治療，其在臨床使用的復合溶葡萄球菌酶消毒制劑可配制成水劑、噴霧劑、膏劑、漱口劑、滴耳劑、洗消劑等。

2.1 皮膚消毒

復合溶菌酶消毒劑無刺激、可反復使用，對醫院內的交叉感染、燒傷和手術病人細菌感染，尤其是耐藥性金黃色葡萄球菌的感染有很好效果，可用于手術前醫護人員或病人手術前局部及全身皮膚的消毒〔28〕。羅引珍等〔29〕報道應用于復合溶菌酶消毒劑對幼兒手去污染效果好于肥皂流水洗手，并具有一定持續效果。

2.2 粘膜消毒

體外殺菌實驗證明，復合溶菌酶能有效抑制和殺掉口咽部致病菌。長征醫院對45例急慢性咽炎、扁桃體炎患者用溶葡萄球菌酶復方制劑治療顯示，有效率達到90.0%，在治療7天后咽部細菌培養陰性〔30〕。李瑛等〔31〕用直接涂片法觀察152例經溶菌酶治療的口腔炎性疾患病例用藥前后口腔菌群的變化。經細菌學檢測，復合溶葡萄球菌酶對口腔中的革蘭陽性細菌和某些陰性細菌有明顯的抑殺作用，用藥后口腔細菌的數量和細菌陽性率均有明顯下降。

馬先軍等〔32〕研究了局部病灶噴涂復合溶葡萄球菌酶口腔噴劑，發現可達到殺滅病原菌的目的，對治療輕中度冠周炎患者，為較好的一種新方法。韓劍星等〔33〕發現復合溶葡萄球菌酶用于治療小兒口腔白色念球菌病，療程短，治愈率高。孫穎麗等〔34〕研究了新型口腔清潔劑對呼吸相關肺炎及口腔潰瘍的作用，結果顯示在傳統口腔護理基礎上給予新境界噴霧劑能有效地減少病人口腔潰瘍和呼吸機相關肺炎（VAP）的發生。同時，復旦大學體外抗流感病毒研究中顯示：復合溶溶葡萄球菌酶制劑具有殺滅流感病毒的作用，其效果和磷酸奧司他韋沒有差別，在預防流感流行中具有一定的應用前景〔35〕。還有學者進行局部使用溶葡萄球菌酶治療持久性鼻腔葡萄球菌攜帶的有效性和安全性研究〔36〕，結果顯示治療5d可以顯著降低葡萄球菌的攜帶率，并且沒有檢測到副作用。經對溶葡萄球菌乳膏根除棉鼠模型金黃色葡萄球菌鼻定植的效果研究顯示〔37〕，單次給藥量150μg溶葡萄球菌酶和礦脂乳膏，100%試驗動物金黃色葡萄球菌鼻定植顯著減少，棉鼠模型金黃色葡萄球菌鼻定植清除率93%。單劑量溶葡萄球菌酶乳膏比單劑量莫匹羅星軟膏和Nisin更有效地根除金黃色葡萄球菌鼻定植。Cui等〔38〕研究了載溶葡萄球菌酶殼聚糖-水包油乳膏制備方法及其對金黃色葡萄球菌的抑制效果。結果表明，溶葡萄球菌酶的濃度與其從乳膏中釋放行為有直接關系。2mg/g和3.5mg/g時溶葡萄球菌酶快速的從乳膏中釋放出來，而溶葡萄球菌酶的濃度載5mg/g時表現出穩定釋放的狀態。同時相比于石墨微粒的空白對照組，具有緩釋溶葡萄球菌酶效果的CCL乳膏對金黃色葡萄球菌的抑制效果比傳統的治療效果好。

2.3 創面消毒

復合溶葡萄球菌酶消毒制劑適用于所有創面感染的預防和治療，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染效果明顯。包括燒傷，燙傷，刀傷，骨創傷，褥瘡、竇道、糖尿病足等經久不愈的感染創面，癤、癰、膿皰瘡、甲溝炎、膿腫、乳腺炎等皮膚和皮下組織感染；肛瘺、肛周膿腫、手術等切口感染，靜脈插管及長期接受導管治療的局部感染等的預防與控制。

首都醫科大學附屬朝陽醫院〔39〕對肛瘺患者使用復合溶葡萄球菌酶殺菌紗布進行治療，結果顯示其應用于肛瘺術后創面，對創面細菌具有較強的殺滅作用，細菌清除率高；可明顯降低創緣炎性反應，減少創面滲出，并可加速創面愈合；臨床應用安全，對創面無刺激。郇京寧等〔27〕在對燒傷患者創面的細菌感染治療研究中發現，溶葡萄球菌酶制劑能有效控制燒傷創面MRSA感染。

2.4 其他方面

復合溶菌酶消毒劑在1μg/ml的濃度下不僅能夠殺滅塑料和玻璃表面生物膜上葡萄球菌也能徹底破壞葡萄球菌生物膜基質〔7〕。復合溶菌酶消毒劑還可配制成噴霧劑、膏劑,漱口劑、滴耳劑、洗消劑、婦女洗液、鼻部噴劑、足部消毒劑等，并且可代替一些有害的化學防腐劑應用于水產、香腸、奶油、生面條等食品保藏。

3 溶葡萄球菌酶的檢測方法

溶葡萄球菌酶是以溶葡萄球菌酶和溶菌酶為主要成分的，其中以溶菌酶的檢測方法已有國家標準要求〔40〕，采用比濁法檢測，本文只針對溶葡萄球菌酶的檢測方法進行綜述。

目前國內外還沒有統一的標準用于檢測溶葡萄球菌酶酶活性，文獻報道的溶葡萄球菌酶酶活性測定方法主要有比濁法，比色法和6甘氨酸底物法。

3.1 比濁法

這是最常用的一種方法，檢測時可將金黃色葡萄球菌的新鮮培養物懸于0.05mol/L Tris-HCL、0.145mol/L NaCl的緩沖液（pH7.5）中，溶葡萄球菌酶作用過程中定量的降低菌液的濁度，濁度下降值與酶量成正比，通過吸光度下降值的測定可計算出樣品的酶活性。Sigma和Ambi公司常采用此方法進行溶葡萄球菌酶活性的測定。

3.2 比色法

Zhou等〔41〕報道了利用比色法進行溶葡萄球菌酶活性測定。以偶聯活性艷藍染料KNR的金黃色葡萄球菌細胞壁肽聚糖（KNR-PG）為色源底物，根據酶作用過程中定量的釋放的帶有KNR染料基因的小分子可溶性片段產物，再除去未反應的不溶性底物后，對上清液進行比色測定，計算酶活性。此法簡便易行，靈敏直觀。

3.3 甘氨酸底物測定法

Kline等〔42〕報道了利用6-甘氨酸底物定量檢測溶葡萄球菌酶活性的方法。通過將6-甘氨酸肽進行乙酰化，作為測定用底物，在檢測時，被酶水解的底物肽的N端基團游離出來，與加入的TNBS反應形成顯色基團，經過一定時間的發色反應，通過顯色基團的光密度值回算出酶活性。此方法專一性高，但底物的合成及后期制備都比較復雜，周期也較長，且相比于比濁和比色方法，費用也較高。

3.4 3種檢測方法的比較

3.4.1 線性范圍和檢測線  比濁法線性范圍相對較窄，當反應體系中酶終濃度在0.1～0.25U /ml較窄的范圍內具有較好的線性，相關系數在99%左右，而6-甘氨酸法中酶濃度在1.25～20μg/ml范圍內都具有較好的相關性，相關系數可達99%，比色法反應體系中酶的終濃度范圍可在0.2～1.0U /ml，相關系數可達99%，明顯優于比濁法，同時，檢測下限又明顯優于6-甘氨酸法。

3.4.2 反應時間  比濁法的反應時間為10min，是3種方法中最短的。6-甘氨酸法所需的反應時間最少60min，加之顯色時間需20min，整個檢測時間相對較長，而比色法的反應時間為20min,之后的離心時間約10min，整個檢測時間相對較短。

3.4.3 檢測用底物及其制備方法  在比濁法檢測中使用的底物為金黃色葡萄球菌菌體細胞，雖然制備簡單，但使用周期短，不易保存，穩定性較差，且存在一定的生物安全隱患，6-甘氨酸法的的底物使用的是乙酰化的6-甘氨酸肽，所制備的母液需平衡8w，作為正式使用的底物則仍需要在使用前至少平衡4w，整個制備過程復雜且漫長，而比色法的底物則采用金黃色葡萄球菌死菌體進行一系列簡單處理后，得到肽聚糖組分，再用活性染料進行染色，整個制備周期為一星期，并可進行大批量的制備，制備好的底物可以于4℃長期保存放置，使用周期長，穩定性好，安全性高。

3.4.4 重復性  由于比濁法中菌體生長不易控制，及底物菌體的活力偏差較大，直接影響測定的結果，在檢測時需盡可能保持每次測定時所用菌體活力的一致，且菌體濁度只有在0.25～0.3時才具有較好的重復性，而6-甘氨酸法則需要在較低的底物濃度下進行，為保證良好的重復性，必須嚴格控制好底物濃度，在比色法中底物是過量的，相對于比濁法，由于是死菌體制備的，不存在明顯的偏差，使檢測過程更容易控制，重復性更好。

綜上所述，色源底物比色法從底物制備的方法簡易程度、酶活性檢測時間的長短、檢測數據的重復性及精密性，均顯示其作為溶菌葡萄球菌酶的活性檢測方法具有明顯優勢。