酶的純化與活力測定

酶的純化與活力測定
在酶學和酶工程的生產和研究中，經常需要進行酶活力的測定，以確定酶量的多少以及變化情況。酶活力測定是在一定條件下測定酶所催化的反應速度。在外界條件相同的情況下，反應速度越大，意味著酶的活力越高。
1 酶活力測定的方法
酶活力測定的方法很多，如化學測定法、光學測定法、氣體測定法等。酶活力測定均包括兩個階段：首先是在一定條件下，酶與底物反應一段時間，然后再測定反應體系中底物或產物的變化量。一般經過以下幾個步驟：
（1）根據酶催化的專一性，選擇適宜的底物，并配制成一定濃度的底物溶液。所用的底物必須均勻一致，達到酶催化反應所要求的純度。
（2）根據酶的動力學性質，確定酶催化反應的pH值、溫度、底物濃度、激活劑濃度等反應條件，底物濃度應該大于5Km（Km見本章7.3.1.1）
（3）在一定條件下，將一定量的酶液和底物溶液混合均勻，適時記錄反應開始的時間。
（4）反應到一定的時間，取出適量的反應液，運用各種檢測技術，測定產物的生成量或底物的減少量。
2 酶的活力單位
酶活力的高低，是以酶活力的單位數來表示。
（1）國際單位 1961年國際生物化學與分子生物學聯合會規定：在特定條件下（溫度可采用25℃或其他選用的溫度，pH值等條件均采用最適條件），每1min催化1μmol的底物轉化為產物的酶量定義為1個酶活力單位。
（2）比活力 是酶純度的一個指標，是指在特定的條件下，每mg蛋白或RNA所具有的酶活力單位數。即：
酶比活力＝酶活力（單位）／mg（蛋白或RNA）
（3）酶的轉換數與催化周期 酶的轉換數Kcat是指每個酶分子每分鐘催化底物轉化的分子數，即是每摩爾酶每分鐘催化底物轉變為產物的摩爾數，是酶的一個指標。一般酶的轉換數在103 min-1。轉換數的倒數稱為酶的催化周期。催化周期是指酶進行一次催化所需的時間，單位為毫秒（ms）或微秒（μs）。
3 酶的純化
在食品加工過程中使用的酶究竟要達到怎樣的純度主要取決于這樣的考慮：一種酶制劑是否含有其他的酶或組分。一種食品級酶制劑必須符合食品法規，但不要求是純酶，它可以含有其他的雜酶，當然還含有各種非酶的組分。這些雜酶和非酶組分對于食品加工可能會帶來有益的或有害的作用。例如，用于澄清果汁的果膠酶往往是從霉菌粗提取物制備的，除了聚半乳糖醛酸酶外，它還含有幾種別的水解酶，在這種酶反應體系中，其他酶種，特別是果膠酯酶（pectinesterase EC 3.1.1.11）實際上對加工工藝是有益的。在另外一些情況下，酶制劑中的雜酶或許會有害于加工工藝，例如，在脂酶（lipase EC 3.1.1.3）制劑中含有脂肪氧合酶（lipoxygenase EC 1.13.11.12），即使活力很低，也會造成脂肪氧化和產生不良的風味。但由于經濟上的原因總是盡可能地避免將酶“純化”，因為從微生物和其他來源得到的粗酶提取物中含有許多不同的酶，將它們完全分離是非常困難和代價昂貴的。