直 接 競 爭ELISA 法檢測可溶性抗原 該檢測方法是使用特異性抗體和毫克級純化或半純化抗原來定性或定量測定可溶性抗原的最有效的方法（圖 1.1. 2)。用抗體替換特異性的酶標抗體，就可轉為間接方法，以種屬特異性或同種型特異性酶結合物作為第三種試劑即可檢測結合的特異性抗體的量。
 附 加 材 料 （其他材料見基本方案）堿性磷酸酶標記的特異性抗體 標準抗原溶液 待測抗原溶液： 0.2?10ug抗原/ml，純化或部分純化，用 PBSN配制， 4°C下保存圓底或錐底微量滴定板 1.十字交叉連續稀釋分析法確定包被試劑和堿性磷酸酶-抗體結合物的最適濃度，標準抗 原 溶 液 （包被試劑）和 結 合 物 （顯色劑）濃 度 各 不 相 同 （見輔助方案）。用封閉緩沖液稀釋結合物，配 制 濃 度 為 最 適 濃 度 （通 常 為 25?500ng抗體/ml) 2 倍 （2 X )的結合物溶液。每個滴定板需3ml結合物溶液。 2.用 50ul標準抗原溶液包被Immulon微量滴定板，并 封 閉 （見基本方案，步 驟 2?5)。 3.為了繪制標準抑制曲線（步 驟 10)，用封閉緩沖液對標準抗原溶液做連續6 次 1 : 3(V/V) 的 稀 釋 （見輔助方案）。應 使 用 抑 制 作 用 動 態 范 圍 大 （1 5 % ?8 5 % ，通常是1?250ng/ml) 的若干稀釋度，每個滴定孔每個稀釋度需75ul以 上 。 抑制作用動態范圍在最初的實驗里以經驗確定，抗原濃度一般在10-6 mol/L 和10-12mol/L 范圍內變動。對于大多數蛋白質抗原，初 始 濃 度 應 在IOiUgAnl左右，用封閉緩沖液以1 : 4 (v/v ) 連 續 稀 釋 9 次，在標準檢測條件下檢測這些抗原稀釋液抑制結合物與抗原包被滴定板結合的能力。 4.圓底或錐底微量滴定板每孔中加入75ull2 X 結合物溶液，而 后 加 入 75ul抑 制 劑 [待測抗原溶液或者是標準抗原溶液（步 驟 3)]，混合孵育。將 等 體 積 的 2 X 結合物溶液與封閉緩沖液混合配制成未抑制的對照樣本，用微量移液管上下混勻3 次 后 ，于室溫下孵育> 3 0 min。如需要，測定待測溶液的2?3 個稀釋度，以 期 在 1 5 % ?8 5 % 范圍內產生抑制作用。 5.轉 移 50ul結合物與抑制劑的混合液或對照樣本到一抗原包被的滴定板上（步 驟 2)。對照樣本放在第11列 ；單 純 底 物 溶 液 （無結合物）放 在 第 1 2 列 。如要測復份樣品，則將其放入同一塊板的相鄰一列中。如需精確定量分析，每塊板上應含有同源抗原溶液的不同稀釋液（步 驟 3)，于室溫下孵育2h。 6.洗 滌 滴 定 板 （見基本方案，步 驟 7)，每孔中加入75M1 MUP或 NPP底物溶液，室溫下 孵 育 lh 。 7.至 少 1h 以后，無抑制反應中的底物充分顯色，可用微量滴定板檢測儀精確測量抑制作用。 8.基于標準抗原溶液稀釋液抑制作用繪制標準抗原-抑制曲線，抗 原 濃 度 對 數 值 為 x軸 ，焚光度或吸光度為： y 軸 。 9.用內插法在標準抗原抑制曲線中求出待測溶液中抗原濃度。線性偏差表明特異性抗體是異質性的，有明顯不同的親和力，或可能是配制的標準抗原溶液含異質性抗原。 展開 | 
