酶聯免疫吸附試驗——抗體檢測實驗(ELISA試

該檢測方法使用毫克級的純化或半純化抗原，能篩選抗血清和雜交瘤上清液中的特 異性抗體（圖1.1. 1)。Img純化抗原可用于80?800個微量滴定板的篩選。

一、實驗材料：

1. 顯色劑：堿性磷酸酶標記的蛋白A (Sigma公司），堿性磷酸酶標記的蛋白G (Calbiochem公司），堿性磷酸酶標記的抗球蛋白抗體

2. 抗原包被液

3. PBSN: PBS (附錄 1)中含 0.05 % (m/V) NaN3

4. 水：去離子或蒸餾

5. 封閉緩沖液

6. 待檢抗體標本溶液：用封閉緩沖液以I : 5 (WV)稀釋的雜交瘤上清液（單元 1.4 ) 或腹水（單元1.4)或1 : 500 (WV)稀釋的抗血清（單元1.2)，于錐底或圓底微量滴定板中配制（適量未免疫腹水或血清作陰性對照）；

7. MUP 或 NPP 底物溶液

8. 0.5mol/LNaOH (可選擇的）

9. 多道移液管、一次性槍頭

10. Immulon 2或 Immulon 4 (Dynatech公司）滴定板或其他等同的微量滴定板；

11. 塑料沖洗瓶

12. 微量滴定板讀板儀（可選擇的）：配有405nm濾光片的分光光度計、配有365nm 激發濾光片或450nm發射濾光片熒光分光光度計

13. 紫外燈，長波長（可選擇的）；

二、實驗方法

1. 十字交叉連續稀釋分析法確定顯色劑（酶標抗體）最適濃度（見輔助方案）。

   如要檢測所有結合抗原的抗體，酶標抗體中抗體應含抗IgK和X輕鏈抗體。也可 用適宜的酶標蛋白A或酶標蛋白G篩選單克隆抗體。能與酶標蛋白A或酶標蛋白G 結合的特異單克隆抗體易于純化和顯示特性。

2. 十字交叉連續稀釋分析法確定抗原包被液終濃度（見輔助方案）。用PBSN配制這種 終濃度抗原溶液（純抗原溶液通常為 0.2 ? 10.O/ug/ml或 ≦ 2 ug/ml)。抗原應占全部蛋白質的 3% 以上，全部蛋白質濃度應小于10 ug/ml。每塊板大約需 6 ml 抗原溶液。

   有些抗原在不同的 pH 下包被更有效率。

3. 使用多道移液管和槍頭，在 Immulon 微量滴定板每孔中加入 50ul 抗原溶液，并將每個孔中的抗原溶液充分振蕩混勻。用塑料蓋封蓋滴定板，室溫下過夜孵育或 37°C 下孵育 2 h。如需要，可將封蓋的滴定板在 4°C 下保存數月。

4. 棄去包被液，在水槽上方將洗瓶里或水龍頭中去離子水或蒸餾水注入包被滴定板的 孔中，洗滌滴定板 2 遍以上。

5. 將洗瓶里的封閉緩沖液注入每個孔內，室溫下孵育 30 min。用水洗滌滴定板 3 次，后于大張吸水紙上拍干去除殘留液，倒扣在紙巾上。

6. 在每個包被過的孔內加入 50ul 用封閉緩沖液稀釋的待測抗體標本溶液。實驗中注意 重復利用沾染同樣溶液的槍頭，移液過程中用吸水紙去除槍頭殘留液。用封閉緩沖 液洗滌槍頭 5 次，小心地將殘留液棄至紙上。防止槍頭中有氣泡，如氣泡去不掉則 更換槍頭。用塑料蓋封蓋滴定板，室溫下孵育 2 h 以上。

7. 用水洗滌滴定板 3 次。將封閉緩沖液注入每個孔中，振蕩混勻，室溫下孵育 10 min。 用水洗滌 3 次去除殘留液。

8. 每孔中加入 50ul 含顯色劑的封閉緩沖液（步驟 1 中選定的最適濃度）。用塑料封套包 裹，室溫下孵育 2 h 以上。按步驟 7 洗滌滴定板。如需要，在加底物前滴定板可于 4°C 條件下保存數月。

9. 每孔中加入 75ul MUP或NPP底物溶液，室溫下孵育 1h。目測觀察定性顯色反應， 或用微量滴定板讀板儀定量檢測（見下述）。之后觀察顯色反應以檢測結合的低濃度 抗體（顏色深度與顯色時間呈正比），加入 25ul 0.5mol/L NaOH 終止顯色。

   (1) 目測出現黃色即發生NPP的顯色反應。也可用配有405nm濾光片的微量滴定板 讀板儀定量測定。
   (2)暗室內用長波長紫外燈照明，目測MUP的顯色作用。也可用365nm激發濾光 片、450nm發射濾光片，以熒光分光光度計定量測定。