實驗概要 本實驗介紹了酶聯免疫吸附試驗C1q測定法的操作流程。包被于塑料板上的固相凝聚IgG與酶聯C1q的結合受標本中免疫復合物的抑制，是一種競爭性抑制試驗。為避免標本中內源C1q的干擾，應預先用IgG免疫吸附劑將其除去。 主要試劑 1. 免疫吸附劑系結合有IgG的纖維素。取纖維素(5%，pH值10.5)與溴化氰一起室溫反應10min，用0.1mol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH值8.0)充分洗滌。再與IgG一起于4℃下作用18h(20ml緩沖液中含3g纖維素和100mg IgG)。制備物用27mol/L甘氨酸緩沖液(pH值8.0)配成20%(W/V)懸液，貯于4℃。 2. 酶聯C1q用戊二醛法將辣根過氧化物酶標記C1q，再經超濾AmiconXM200濾膜)分離貯于－20℃。 3. 其他試劑0.02mol/L TrisHCl緩沖液(pH值9.0)；0.2mol/L TrisHCl緩沖液(pH 值7.4)，以及含0.05%Tween20的同一緩沖液；0.2mol/L EDTA (pH值7.6)；酶底物溶液和中止液。 主要設備 聚苯乙烯反應板，酶聯免疫檢測儀。 實驗步驟 1. 包被凝聚IgG取經0.02mol/L TrisHCl緩沖液(pH值9.0)透析過夜的凝聚IgG(100μg/ml)，加入聚苯乙烯板孔內，每孔100μl，37℃包被30min后，用緩沖液洗3次(第1次、第3次用0.2mol/L TrisHCl緩沖液(pH值7.4)；第2次用含0.05% Tween20的同一緩沖液)，真空干燥，貯于4℃。 2. 取血清標本50μl，加入0.2mol/L EDTA(pH值7.6)50μl，室溫作用10min，使內源C1q游離，然后加入IgG免疫吸附劑500μl，室溫振蕩20min，再以500r/min離心5min，得到1∶10稀釋的上清液。 3. 取已包被凝聚IgG的塑料反應板，每孔中加入上述上清液90μl，酶聯C1q10μl(1∶100 ～200稀釋液)，室溫下反應20min，然后用含0.2mol/L NaCl，0.05%Tween20的0.2mol/L TrisHCl緩沖液(pH值7.4)洗3次，再加入100μl底物溶液(pH值6.0、0.1mol/L磷酸鹽枸櫞酸鹽緩沖液50ml中，加入鄰苯二胺20mg，30%(W/V)過氧化氫10μl)，室溫放30min，加入2mol/L硫酸50μl中止反應，于492nm讀取吸光值。如果定量，可用凝聚IgG制作標準曲線，測出免疫復合物的相對含量。 |