實驗概要
本實驗介紹了酸性α醋酸萘酯酶染色法的原理、操作流程及注意事項等。
實驗原理
淋巴細胞內含有許多種酶，如α醋酸萘酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、β葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴細胞細胞亞群所含酶類及其含量各異，如淋巴母細胞富含ACP，而成熟的T淋巴細胞則顯示ANAE活性，因此可利用化學反應作檢測。T淋巴細胞漿內含有的酸性α醋酸萘酯酶(acid αnaphthyl acetate esterase，ANAE)，在弱酸性條件下，能使底物酸性α醋酸萘酯水解成醋酸和α萘酚，后者與六偶氮副品紅偶聯，生成不溶性的紅色沉淀物，沉積在T淋巴細胞胞漿內酯酶所在的部位，經甲基綠復染，反應呈現單一或散在的顆粒或斑塊，顯棕紅色。B淋巴細胞則無此種反應。因此ANAE染色法可作為鑒別T淋巴細胞的一種非特異性方法。此外，單核細胞、中性粒細胞、酸性粒細胞及血小板等也可呈現酯酶染色陽性反應，應當注意區分。
主要試劑
1. 25%戊二醛溶液(固定液) 在0.1mol/L pH值7.4磷酸鹽緩沖液9ml中加入25%戊二醛溶液1ml混和，置4℃冰箱保存備用。
2. 副品紅液 將副品紅4g加入2mol/L鹽酸100ml中，37℃溶解過濾，4℃冰箱保存備用。
3. 4%亞硝酸鈉溶液 取亞硝酸鈉400mg，溶于蒸餾水10ml中，臨用前配制。
4. 六偶氮副品紅溶液 取新配制的亞硝酸鈉溶液3ml，慢慢滴入副品紅溶液3ml中，邊滴邊攪拌，此時有刺激性氣體產生。充分混合，1min后備用。
5. α醋酸萘酯溶液：
α醋酸萘酯2g 乙二醇單甲醚100ml 也可用丙酮100ml代替乙二醇單甲醚。
6. 0.067(1/15)mol/L pH值7.6磷酸鹽緩沖液：
甲液 KH2PO4 9.08g加蒸餾水至1，000ml
乙液 Na2HPO4 9.74g加蒸餾水至1，000ml。(如為Na2HPO4?12H2O則稱取23.22g)
取甲液13ml，加入乙液87ml，即為0.067mol/L pH值7.6磷酸鹽緩沖液。
7. 反應液
0.067mol/L pH值7.6磷酸鹽緩沖液89ml 六偶氮副品紅 6ml(緩慢加入) α醋酸萘酯液25ml(緩慢加入)
8. 甲基綠染色液充分混勻，調pH值5.8～6.0，臨用前配制。
甲基綠1g 蒸餾水100ml 置37℃溶解，冰箱保存備用。
實驗步驟
1. 分離單個核細胞 取家兔肝素抗凝血1ml加入Hank's液1ml，加入到含有2ml淋巴細胞分層液(比重1077±0001)的離心管中，以2 000 r/min離心30min。洗滌后，加少量Hanks液，搖勻。
2. 制片 取上述細胞懸液1滴，加到潔凈玻片上，涂片，自然干燥。
3. 固定和染色 將制備的細胞涂片用25%戊二醛液4℃固定10min，流水沖洗，待干。將玻片置于反應液內，37℃孵育1h，取出用水沖洗，待干。
4. 復染 用甲基綠染色液染1min(或瞬時染色)，水洗，吹干。油浸鏡下觀察計數。
注意事項
1. 不同質量的試劑，尤其是偶氮染料對反應產物的顏色、鮮艷程度、顆粒粗細和定位清晰程度等影響很大，應加注意。
2. 由于本反應為酶化學反應，反應非常靈敏，各種條件應嚴格掌握。尤其是試劑的pH值要求準確，需用精密pH試紙或pH計測定。
3. 配制反應液時，各溶液混合，必須邊搖邊緩慢加入，若滴入過快，可出現沉淀，影響染色結果。
4. 制片過程中，標本要求盡快固定、干燥和沖洗。若時間過長，可影響酯酶活性。
5. 涂片插入染色缸時，要注意必須將標本面與反應液接觸，切勿將標本面緊貼缸壁，以免影響染色反應。如片子較多，反應液相對減少，會使陽性率減低。
染色后沖洗不宜過久，防止酶反應產物的紅色消減，造成標本觀察困難。