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  • 發布時間:2019-04-20 21:20 原文鏈接: 酸性磷酸酶的顯示方法

    實驗概要

    酸性磷酸酶能分解磷酸脂而釋放出磷酸基。在pH5.0的環境中,磷酸基能與鉛鹽反應形成磷酸鉛。但因其是無色的,所以再經過與硫化銨作用,形成棕黑色的硫化鉛沉淀,由此就能顯示酸性磷酸酶在細胞內的存在與分布。

    主要試劑

    1.   10%中性福爾馬林(pH6.8~7.1)甲醛 10ml 蒸餾水 90ml 醋酸鈉 2g

    2.   酸性磷酸酶作用液

      蒸餾水 90ml 0.2mol/L醋酸緩沖液(pH4.6) 12ml 5%硝酸鉛 2ml

    3.   2%β—甘油磷酸鈉 4ml

        先將蒸餾水和醋酸緩沖液混合,隨后分成大致相等的兩份,一份中加硝酸鉛溶液,另一份加甘油磷酸鈉溶液,然后再將兩者緩緩混合,邊混邊攪勻后若酸堿度值不到pH5.0,可加少量醋酸的調整。此作用液最好在臨用前配制,不能貯存。配好后的作用液應透明無絮狀懸浮物和沉淀,否則將嚴重影響實驗結果。

    4.   1%硫化胺溶液

      硫化胺 1ml 蒸餾水 9ml

    5.   姬姆薩染液(1:30)

      姬姆薩原液 3滴 磷酸鹽緩沖液(pH6.8) 5ml

    6.   6%淀粉肉湯

      牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1.0g 氯化鈉 0.5g 蒸餾水 100ml

      高壓滅菌9.9×104pa(15磅)20min,再加入可溶性淀粉6g,水溫浴,促使溶解后置冰箱保存備用。

    實驗步驟

    1.   取小白鼠一只,每日腹腔注射6%淀粉肉湯1ml,連續注射三天。

    2.   在第三天注射后3~4h,再向腹腔注射生理鹽水1ml,過3min后在原注射部位抽取腹腔液0.1~0.2ml。請注意!注射和抽液的進針部位和深度要保持一致。否則可能抽不出腹腔液。

    3.   將腹腔液滴在預冷的載玻片上,每片1~2滴,涂片,將玻片垂直插入玻片架,迅速放到冰箱內(4℃),讓細胞自行鋪展。

    4.   30min后,將玻片轉入10%中性福爾馬林,冰箱內4℃固定30min。

    5.   自來水漂洗5min,把水甩干。

    6.   轉入酸性磷酸酶作用液中,37℃處理30min。

    7.   自來水漂洗片刻。

    8.   1%硫化胺處理3~5min。

    9.   自來水沖洗,甩干。

    10.用1∶30的姬姆薩染液染色15min。

    11.自來水沖去染液,用磷酸鹽緩沖液臨時封片,鏡檢。

    12.對照實驗:

    將第3步的腹腔液涂片置50℃溫箱中處理30min,使酶失活,再進行6~11步的同樣實驗。


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