因此,在電泳時應盡量避免使用具有高電滲作用的支持物。
醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法。
醋酸纖維薄膜由二乙酸纖維素制成,它具有均一的泡沫樣的結構,厚度僅120微米,有強滲透性,對分子移動無阻力,作為區帶電泳的支持物進行蛋白電泳有簡便、快速、樣品用量少、應用范圍廣、分離清晰、沒有吸附現象等優點。目前已廣泛用于血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白和同功酶的分離及用在免疫電泳中。
三、器材及試劑:
1.器材
①醋酸纖維薄膜(2×8cm)
②常壓電泳儀
③點樣器(蓋玻片)
④培養皿(染色及漂洗用)
⑤粗濾紙
⑥玻璃板
⑦竹鑷
⑧白磁反應板
⑨人血清或雞血清
2.試劑:
①巴比妥緩沖液(PH8.6,離子強度0.07):巴比妥2.76克,巴比妥納15.45克,加水至1000毫升。
②染色液:含氨基黑10B0.25克,甲醇50毫升,冰醋酸10毫升,水40毫升(可重復使用)。
③漂洗液:含甲醇或乙醇45毫升,冰醋酸5毫升,水50毫升。
④透明液:含無水乙醇7份,冰醋酸3份。
四、操作步驟:
1.浸泡:用鑷子取醋酸纖維薄膜1張(識別出光澤面與無光澤面,并在角上用鉛筆做上記號)放在緩沖液中浸泡20分鐘。
2.點樣:把膜條從緩沖液中取出,夾在兩層粗濾紙內吸干多余的液體,然后平鋪在玻璃板上(無光澤面朝上),將點樣器先在白磁板上的血清中沾一下,再在膜條一端2—3厘米處輕輕地水平落下并隨即提起,這樣即在膜條上點上了細條狀的血清樣品。
3.電泳:在電泳槽內加入緩沖液,使兩個電極槽內的液面等高,將膜條平懸于電泳槽支架的濾紙橋上。(先剪裁尺寸合適的濾紙條,取雙層濾紙條附著在電泳槽的支架上,使它的一端與支架的前沿對齊,而另一端浸入電極槽的緩沖液內。用緩沖液將濾紙全部潤濕并驅除氣泡,使濾紙緊貼在支架上,即為濾紙橋。它是聯系醋酸纖維薄膜和兩極緩沖液之間的“橋梁”。)膜條上點樣的一端靠近負極。蓋嚴電泳室。通電。調節電壓至160V,電流強度0.4—0.7毫安/厘米膜寬,電泳時間約為60分鐘。
4.染色:電泳完畢后將膜條取下并放在染色液中浸泡10分鐘。
5.漂洗:將膜條從染色液中取出,置漂洗液中漂洗數次至無蛋白區底色脫凈為止,可得色帶清晰的電泳圖譜。
6.定量:有兩種方法
(1)將上述漂凈的薄膜用濾紙吸干,剪下各種蛋白質色帶,分別浸于4.0ml0.4mol·l-1NaOH溶液中(37℃)5—10分鐘,色澤浸出后,比色(590nm)。設各部分的光密度分別為:
(2)把薄膜放在濾紙上用電吹風吹干,待薄膜完全干燥后,浸入透明液中約5—10分鐘,取出,平貼于干凈玻璃片上,自然干燥或用電吹風冷風吹干,即得背景透明的電泳圖譜,可用刀片刮開并從玻板上取下圖譜。能用光密度計測定各蛋白斑點。此圖譜可長期保存。
用本法測得血清蛋白各組分的正常值為:
白蛋白=67.24%(61.2—74.5%)
α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白=16.92%(11.2—22%)
γ球蛋白=15.84%(10.4—20.6%)