采用改進的CTAB法提取細菌總DNA

實驗概要

通過改進的CTAB法可快速簡便的提取細菌總DNA，通過本實驗可掌握CTAB法從細菌提取DNA的原理和方法。

實驗原理

CTAB  (hexadecyltrimethylammonium  bromide，十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽離子去污劑，具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L   NaCl)，CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。

主要試劑

2×CTAB提取緩沖液 [ 詳細信息：100mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%(w/v) CTAB，40mmol/L 巰基乙醇（隨用隨加）]

TE 緩沖液 [ 詳細信息：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA ]

氯仿/異戊醇（24 /1）

酚/氯仿/異戊醇（24/25/1）

70%乙醇

蛋白酶K 20 mg/mL

10% SDS溶液

主要設備

冷凍高速離心機

臺式高速離心機

移液器

水浴鍋

錐形瓶

離心管 [ 詳細信息：15mL和1.5mL]

小玻棒 [ 詳細信息：形狀為彎成鉤狀的 ]

實驗材料

大腸桿菌

實驗步驟

1. 從 LB 平板上挑取大腸桿菌單菌落接種至 4 mL LB 液體培養基中，振蕩培養過夜（37℃，200 r/min）；培養物按 3% 接種量轉接至含 25 mL 培養基的 250 mL 錐形瓶，培養至特定 OD600 值。

2. 挑取初生型單菌落，培養至穩定期，取菌液 3 mL，12000 r/min 高速離心 5 min，徹底去除上清液；

3. 加入 50 μL TE 緩沖液，充分懸浮細菌；

4. 加入 60 μL 10% SDS 溶液，10 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，溫和混勻，37℃溫育 1 h；

5. 加入 100 μL 5 mol/L 的 NaCl 溶液，上下顛倒離心管十多次，充分混勻；

6. 加入 80 μL CTAB/NaCl 溶液，溫和混勻，65℃下溫育 10 min；

7. 加入 700 μL 氯仿/異戊醇，溫和混勻，12000 r/min 高速離心 2 min；

8. 吸取上清至另一干凈離心管，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，上下顛倒混勻，12000 r/min 高速離心 2 min；

9. 吸取上清至另一干凈離心管，加入 2 倍體積冰冷的無水乙醇沉淀 DNA，溫和混勻；

10. 離心（12000 r/min，30 min，4℃），徹底去除上清；

11. 用 300 μL 70% 預冷的乙醇洗滌沉淀，離心（12000 r/min，15 min，4℃），棄上清，再離心幾秒，用移液器徹底除去酒精，風干；

12. 沉淀溶于 100 μL TE 溶液中，-20℃保存；

13. 以紫外分光光度法和 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 濃度和質量。