采用Agilent Femto Pulse系統對不同基因組DNA提取進行質量評估
作者
Chava Pocernich，Jolita Uthe，Steve Siembieda 安捷倫科技有限公司
摘要
Agilent Femto Pulse 系統采用革命性設計，是唯一一款能夠自動進行高分子量 (HMW) gDNA 脈沖場凝膠電泳 (PFGE) 分析的儀器。與傳統 PFGE 分析相比，Femto Pulse 系統能夠在更短時間內對 gDNA 分子量和完整性進行定性分析。應用領域涵蓋三代測序或長讀長測序平臺的小基因組分析到復雜基因組從頭組裝，這些應用要求 HMW gDNA 樣品滿足高質量標準。有多種方法針對特定的下游應用從選取的真核和原核來源樣品中分離 gDNA。而分離 gDNA 的分子量和質量會受到不同提取方法的影響，因此需要對 gDNA 樣品進行可靠的質量評估。安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒專為 Femto Pulse 系統上的 HMW gDNA 分離而設計，可提供準確而重現的分子量和質量評估。利用基因組 DNA 165 kb 分析試劑盒在 Femto Pulse 系統上對比五種不同gDNA 提取方法得到的gDNA 分子量和質量。
前言
大片段基因組文庫（如用于10X Genomics、Oxford Nanopore 和 PacBio Technologies 的文庫）需要起始基因組 DNA (gDNA) 滿足特定質量條件才能成功獲得結果。影響樣品質量的幾個因素包括：提取方法、樣品儲存、反復凍融循環和變性[1]。在提取和處理 gDNA 期間，DNA 可以在許多不同環節發生物理、酶促和化學剪切，變為小片段。因此，準確可靠的 gDNA 質量評估對于這些下游測序過程的成功至關重要。通過確定樣品的片段化和降解程度，部分評估 gDNA 質量。過夜脈沖場凝膠電泳 (PFGE) 通常用于評估高分子量 (HMW) gDNA 的完整性。配備基因組DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統是市面上唯一一款用自動分離系統替代 PFGE 的解決方案，可在短短 70 分鐘內評估 HMW gDNA。
實驗部分
將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 菌株 BY4741（ Dharmacon，部件號YSC1048）在 YPD 肉湯培養基（賽默飛世爾科技公司，部件號 A1374501）中培養 24 小時。離心收集細胞，再按照若干種方案提取 gDNA。方法 A 采用經典的苯酚-氯仿-異戊醇 (25:24:1)（賽默飛世爾科技公司，部件號 AC327111000）提取方案[2]，方法 B、C、D、E 根據以下四種不同市售試劑盒的制造商說明書進行：
Wizard 基因組 DNA 純化試劑盒（Promega Life Sciences，部件號 A1120）、Quick- DNA 通用試劑盒（Zymo Research，部件號 D4068T）、MegaLong gDNA 試劑盒（G-Biosciences，部件號 786-146）、Genomic-tip 20/G 以及基因組 DNA 緩沖液組合（Qiagen，部件號 10223 和19060）。方法 B 是液相提取，方法 C 和 E 是離心柱提取，方法 D 是膜提取。分別通過 PFGE 以及在配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒（部件號 Fp-1002-0275） 的 Agilent Femto Pulse 系統（部件號FPv1-CE2）上采用 FP-1002-22 gDNA 165 kb 方法（快速法）或 FP-1002E22 擴展 gDNA 165 kb 法（擴展法），對提取的 gDNA 進行分離。在 Femto Pulse 系統操作軟件中選擇基因組 DNA 165 kb 快速和擴展法。將 50 ng/μL 左右 gDNA上樣至 0.8% 瓊脂糖凝膠（Lonza SeaKem Agarose，部件號 50152），并用 Pippin- Pulse 預設方案（ 5 至 150 kb）通過PFGE 分離 18 小時 (Sage Sciences)。使用 Agilent FP 165 kb 分子量標準品（165、50、42、23、21、17.7、10 kb）（部件號 FP-7002-U035）和低范圍 PFG 標準品（New England Biolabs，部件號N0350S）。分離后，用 Agilent FP 嵌入染料（部件號 FP-6001-U030）對瓊脂糖凝膠進行后染色，并用紫外透照儀觀察。
結果與討論
在 Femto Pulse 系統上用快速和擴展基因組 DNA 165 kb 方法測定分子量分布
Femto Pulse 系統軟件為基因組 DNA165 kb 試劑盒提供了兩種分離方法。快速法是一種 70 分鐘的脈沖場毛細管電泳 (CE)
分離，最適合對 80 kb 以下的 gDNA 樣品進行分離與分子量測定。擴展法采用另一種持續 3.5 小時的脈沖場 CE
分離方法，專用于改善大于 80 kb 的 gDNA 樣品的分離和分子量測定。用快速法分離的大于 80 kb 的基因組 DNA 峰形尖銳、緊湊，與
165 kb 左右 DNA 的片段峰形相似[3]。導致這一結果的部分原因為脈沖場分離期間用于樣品分離的時間太短。擴展法在更長的分離時間中使用了脈沖場
CE 替代方法，并將相同 gDNA 樣品分離為更寬的彌散條帶，更能代表樣品的整體分子量范圍。擴展法推薦用于大于 80 kb 的 gDNA
樣品（快速法僅能將其分離為 165 kb 左右的緊湊峰）。
Femto Pulse 系統使用基因組
DNA 165 kb擴展法來分離大于 80 kb 的提取 gDNA（圖 1）。使用 Agilent ProSize 數據分析軟件上的
Smear Analysis 選項卡分析 gDNA 的分子量分布。彌散條帶分子量分布包含整個彌散條帶范圍內的濃度分布。酵母 gDNA
的彌散條帶分子量分布和完整性隨使用的提取方法不同而變化。使用提取方法 A、B、C、D、E 得到的基因組 DNA 樣品的彌散條帶分子量依次減小（表
1）。液相提取法 A 和 B 得到了分子量最大的完整 gDNA 彌散條帶。用傳統液體苯酚-氯仿提取法 (A) 提取的基因組 DNA 產生的完整
gDNA 較長，平均為163670 bp，而另一種液相提取方法 B 為103111 bp。方法 C 離心柱 gDNA 提取方法和方法 D 膜 gDNA 提取方法，在五種不同提取方法中表現出相似的彌散條帶分子量分布結果。