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  • 發布時間:2019-03-29 18:31 原文鏈接: 重組蛋白質的代謝標記實驗

    由于重組蛋白質表達的時候,宿主蛋白質的合成基本終止,因此體內代謝標記是檢測重組蛋白質的敏感方法。

    實驗材料

    蛋白質

    試劑、試劑盒

    胎牛血清甲硫氨酸半胱氨酸

    儀器、耗材

    培養瓶離心機轉子

    實驗步驟

    1.  接種2.5×106細胞于盛有4 ml 含10%胎牛血清的完全培養液的60 mm 肌組織培養皿中。對每一假定重組病毒分別準備一個平皿供感染用,并準備一個對照平皿供野生型桿狀病毒感染。于27℃溫育2 h。使細胞貼壁。吸出培養液,然后加入1 ml 含重組病毒或1 ml 含野生型病毒的無血清完全培養液,感染復數(MOI)為5~10。


    2.  將每個平皿中的培養液移去后,再往其中加入3 ml 含10%胎牛血清的完全培養液, 27℃溫育約40 h。

     

    3.  小心去除培養液,用不含甲硫氨酸或不含甲琉氨酸和半胱氨酸的培養液洗細胞一次, 加入1 ml 已添加EXPRE35S35S至0.25~0.5 mCi/ml 的同樣培養液。于27℃溫育3~4 h。

     

    4.  將細胞和培養物上清移至一支15 ml 聚丙烯離心管,4℃ 1 000 g 離心10 min。
     

    5.  進行SDS-PAGE分離裂解物中的蛋白。每條泳道加20~40 μg 細胞總蛋白或全部的免疫沉淀物。

     

    6.  用放射自顯影使蛋白質顯跡。從放射自顯影圖查看感染了重組病毒(而不是野生型桿狀病毒)的細胞是否出現預期分子量的蛋白質。

    展開


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