重組質粒的連接、轉化及篩選

用特定的限制性內切酶切割載體DNA和外源DNA片段并進行純化，于體外使兩者相連接(若用T-載體，可直接用純化的PCR產物進行連接)，轉化宿主細菌后，利用藍白斑篩選原理對重組子進行挑選。由于載體上帶有Amp'和lacZ基因，故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補原理篩選相結合的方法。

初步的抗性篩選：載體上帶有Amp'基因而外源片段上沒有，故轉化受體菌后只有帶有載體DNA的轉化子才能在含有Amp的LB平板上存活下來，而帶有自身環化的外源片段的轉化子則不能存活。

進一步藍白斑篩選：載體上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點，但并沒有破壞lacZ

的閱讀框架，不影響其正常功能。E.coli DH5α、Top10或JM系列菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情況下，載體和菌株編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在載體和菌株融為一體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完整的近操縱基因區段的β-半乳糖苷酶突變體之間實現互補的現象叫α-互補。由α-互補產生的Lac+細菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到載體的多克隆位點后會導致讀碼框改變，表達蛋白失活，產生的氨基酸片段失去α-互補能力，因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。

外源DNA 片段

連接反應緩沖液T4 DNA 連接酶X-gal儲液IPTG儲液麥康凱選擇性培養基

恒溫搖床臺式高速離心機恒溫水浴鍋電泳裝置電熱恒溫培養箱電泳儀移液槍eppendorf管

一、連接反應

將約10ng的載體DNA轉移到無菌微量離心管中，加入至少4倍摩爾量的外源DNA片段，然后加入10×T4 DNA連接酶緩沖液（ligase buffer）1μL，T4 DNA連接酶0.5μL——1μL，加無菌超純水至10μL體積，充分混勻后用微量離心機將液體全部收集至管底，于16℃保溫過夜。

二、E.coli DH5α感受態細胞的轉化

1. 從一70℃冰箱中取200μL（效率高時只需50μL）感受態細胞懸液，置冰上解凍。

2. 待感受態解凍后加入連接產物溶液1IxL——51xL，輕彈混勻，冰上放置30rain。

3. 42℃水浴中孵育90s，并迅速置冰上冷卻3min——5min。

4. 向管中加入lmL LB液體培養基（不含Amp），混勻后37℃振蕩培養lh，使細菌恢復生長，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因（Amp'）。

5. 將上述菌液搖勻后取100μL（如感受態效率低或連接效率低則可將lmL菌液在4500 rpm低轉速離心機中收集全部菌體，并重懸于100μL LB培養液中）涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培養基吸收后，將培養皿倒置于37℃培養16h——24h。

①同時做三個對照

對照1：以等體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，涂板時只取5μL菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。

對照2：以等體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，涂板時只取5μL菌液涂布于含有抗生素的LB平板上。此組正常情況下應沒有菌落出現。

對照3：取一定量已知濃度的對照質粒DNA（為本實驗中的連接載體質粒）加入等量感受態細胞中，其他操作與加入連接體系的相同。此對照在正常情況下應在含抗生素的LB平板上出現較大量的菌落。

②統計每個培養皿中的菌落數

轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：

轉化子總數=菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積/涂板菌液體積

轉化頻率（轉化子數/mg質粒DNA）=轉化子總數/質粒DNA加入量（mg）

感受態細胞總數=對照組1菌落數×稀釋倍數×菌液總體積/涂板菌液體積

感受態細胞轉化效率=轉化子總數/感受態細胞總數

三、重組質粒的篩選與鑒定

帶有T-vector的空載體的轉化子由于具有β-半乳糖苷酶活性，在X-gal和IPTG培養基上為藍色菌落；帶有重組質粒轉化子由于外源DNA片段的插人喪失了β-半乳糖苷酶活性，因而在X-gal和IPTG培養基上為白色菌落。

1. 質粒電泳初步鑒定重組子

用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含Amp 50μg/mL的5mL LB液體培養基中，于37℃振蕩培養12h。用堿裂解法小量制備質粒DNA進行電泳，同時制備T-vector做對照，有插人片段的重組質粒電泳時遷移率較T-vector慢。

2. 質粒酶切確定重組子

用與連接未端相對應的限制性內切酶對以上電泳中遷移率較慢的質粒進一步進行酶切檢驗，同時對空載體進行對照酶切，如果確實插人了外源DNA片斷，就能在電泳中看到與插入片斷大小一致的DNA條帶。

1. T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase）及連接反應緩沖液（10×），購自公司。

2. 相應的內切核酸酶（用于酶切片段和載體及隨后鑒定重組子），購自公司。

3. X-gal貯液（20mg/mL）：直接購買溶液，或用二甲基甲酰胺溶解X-gal固體配制成

20mg／mL的貯液，包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞，貯存于-20℃。

4. IPTG貯液（200mg／mL）：在800μL蒸餾水中溶解200mg IPTG后，用蒸餾水定容至

1mL，用0.22 μm濾膜過濾除菌，分裝于離心管并貯于-20℃。

5. 含X-gal和IPTG的篩選培養基：在涂布轉化子之前，于事先制備好的含100μg/mL

Amp的LB平板表面加40mL X-gal貯液和4μL IPTG貯液，用無菌玻璃涂布器將溶液涂勻，置于37℃下放置3h一4h，使培養基表面的液體完全被吸收。

6. 堿裂解法小量制備質粒試劑。

7. 特定的限制性核酸內切酶及電泳試劑。

常見問題分析及處理：

由于此實驗過程涉及多個實驗環節，如酶切、連接、感受態細胞、轉化等各方面的效率，因此在實驗中經常會出現一些問題。如：

1. 對照1上有大量菌落；對照2上無菌落；對照3上無菌落或有少量菌落；連接體系轉化

平板上無菌落。可能是感受態細胞效率太低所造成，重新制備高效率感受態。

2. 對照1上有大量菌落；對照2上無菌落；對照3上有較大量菌落；連接體系轉化平板上

無菌落。可能說明連接效率太低造成，重新調節連接體系以提高連接效率。

3. 對照1上有大量菌落；對照2上也有菌落；對照3上有菌落；連接體系轉化平板上有菌

落。可能說明感受態細胞受到污染，用新的原始感受態細胞株制備感受態。

4. 對照1上有大量菌落；對照2上無菌落；對照3上有較大量菌落；連接體系轉化平板上

有適量菌落，但只有藍色菌落，無白色菌落。可能說明連接體系的效率太低，轉化的均為載體自連質粒（T載體；或載體酶切不完全，分離純化到的載體中含有未雙酶切的片斷），重新制備片段和載體，調節連接體系，提高連接效率。

5. 來源《分子生物學實驗技術》。