金屬螯合親和層析實驗

蛋白質

IPTG NiSO4 蛋白酶抑制劑 MCAC-EDTA Triton

層析柱 轉子

1.  接種含以pET載體表達帶組氨酸尾融合蛋白的大腸扦菌BL21（DE3）pLyaS菌株于10 ml M9ZB/氨芐青霉素/氯霉素培養基。于37℃搖蕩培養過夜。

2.  轉接1 ml 過夜培養物于100 ml M9ZB/氨芐青霉索/氯霉素培養基，于37℃揺蕩培 養至OD₆₀₀=0.7~1.0。

3.  加入1 ml 0.1 mol/l IPTG，干37℃繼續培養1~3 h。

4.  4 400 g 離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-70℃。
 

往一根1.5 cm×10 cm 層析柱中加入1 ml NTA介質，讓液體剛好流至柱床的頂部， 用下列液體洗柱：

0.5 ml （3個床體積）去離子水

0.5 ml （5個床體積）50 mmol/l NiSO₄·6H₂O

0.5 ml MCAC-0緩沖液
 

6.  將菌體沉淀置于冰浴中凍融，加入5 ml MCAC-0緩沖液和33 μl 150×蛋白酶抑制劑混合液。用吸管吹打重懸，超聲破菌或勻漿。

7.  加入0.05 ml 10%（w/v）Triton X-100溶液（至終濃度0.1%）充分混勻，在 -70℃凍結 10 min。

8.  在冰浴中凍融細胞懸液。于260 000 g 離心60 min，將上清吸至在冰浴中的干凈容器，棄沉淀。取10 μl 小份樣品凍結于-70℃，留待以后分析之用

9.   如果提取液被凍結，在冰上凍融，以10~15 ml/h 的流速上Ni²⁺-NTA柱。收集流出液，保留待進行SDS-PAGE分析。

10.  以20~30 ml/h 的流速用5 ml MCAC-0緩沖液洗柱，棄流出液。

11.  以分段冼脫的方式分別依次用5 ml 下列緩沖液冼柱：MCAC-20、MCAC-40、MCAC-60、MCAC-80、MCAC-100、MCAC-200、MCAC-1000。分部收集每1 ml 洗脫液，保留待SDS-PAGE分析。

12.  在10~15 ml/h 的流速下以5 ml MCAC-EDTA緩沖液洗柱，收集毎1 ml 級分。

13.  分析各級分中所含的冼脫蛋白。

14.  合并含洗脫蛋白質的級分，取出10 μl 用SDS-PAGE分析。必要時，透析除去MCAC緩沖液。將樣品分成小份，在-70℃或液氮中凍結。