鈣調蛋白樣品的測活實驗

MLCK 的底物肽ATP鈣調蛋白儲液MLCK 酶磷酸丙酮（任選）MLCK 測活緩沖液

聚丙烯微量離心管Whatman*P81 磷酸纖維素紙（切成條)玻璃燒杯加樣器閃爍瓶閃爍計數器吹干機（任選)

材料與設備

聚丙烯微量離心管 (1.5-ml)

MLCK 的底物肽（10mmol/L 濃縮儲液；測活時，用水按 1：20 稀釋成 0.5 mmol/L溶液)

ATP（2 mmol/L 儲液，含 5μCi 的 [γ-³²P]ATP/5ul)

鈣調蛋白儲液 (0.1ug/ml 或 1ug/ml)

MLCK 酶（濃縮儲液保存于-70°C; 測活時，用 1mg/ml 牛血清白蛋白按 1:200稀釋）

水浴

Whatman*P81 磷酸纖維素紙（切成條)

磷酸（75 mmol/L)(3X4L)

玻璃燒杯（3~4L 容積)

加樣器（3~10-ml)

閃爍瓶

閃爍計數器

丙酮（任選）

吹干機（任選)

試劑

MLCK 測活緩沖液（10x)

(配方，見“試劑的配制”，PP.82~83)

操作程序

1) 對每次測活，將下列試劑置于一 1.5-ml 聚丙烯微量離心管中:

MLCK 測活緩沖液 (10x)                                                                5ul

MLCK 的底物肽 (0.5 mmol/L)                                                        5ul

[γ-³²P]ATP(2 mmol/L 35uCi/5ul)                                                    5ul

鈣調蛋白（0.1ug/ml 或 1ug/ml) 或各步純化所得的未知樣品         0~20ul

Milli-Q 水                                                                                        10~30ul

MLCK 酶 (儲液按 1:200 稀釋)                                                         5ul

總體積                                                                                             50ul

注：各步純化所得的組分, 若含 EDTA 或 EGTA, 則應制成過量的 1mmol/LCaCl₂ 溶液。每個組分應測幾個稀釋度，如 1:10、1:100 和 1:1000。在上述條件下，鈣調蛋白的半數有效劑置約為 4ng。MLCK 試驗的鈣調蛋白 (0.2~20ng) 標準曲線，見圖 1-2。



2) 開始實驗，加人 MLCK 酶。25°C，孵育 20 min(分鐘)。

3) 將離心管置于冰上。從每管中取出 10-ul 等分試樣，滴于一小面積的 P81 紙上。可用一條 P81 紙條, 在其上每隔 2~3 cm 用鉛筆寫上序號（與離心管的序號對應)。

4) 紙條用 75mmol/L 磷酸洗 3 次，用移液管手動攪拌 ，每次洗滌在玻璃燒杯中進行，用移液管轉移紙條。第一次洗過的溶液應置于放射性廢液中。洗畢，吹干,將紙條剪成小片，置閃爍瓶中計數。或者，紙條也可用丙酮洗滌，并用手持吹干機快速吹干（MarshA 和 Carroll,1991)。