鐘聲教授團隊開發高通量蛋白互作檢測技術

　　通過深入了解基因組產物形成的相互作用網絡，人類基因組注釋功能得以飛速發展。隨著技術的進步，我們已經實現了DNA-DNA、蛋白質 -DNA、RNA-DNA和RNA-RNA相互作用的全基因組映射圖譜。但完成人類蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）的全基因組映射圖譜仍然是一項艱巨任務。

　　目前，大規模PPI映射方法可分為3類，即“并行化一對一”、“一對多”和“多對多”方法。“并行化一對一”方法是利用自動化和并行化來提高酵母雙雜交（Y2H）分析的通量，包括高通量Y2H、MAPPIT 、QIS-seq以及將PPI對的基因序列進行融合測序的RLL-Y2H、Stitch-Seq、CrY2H-seq和BFG-Y2H等方法。“一對多”方法是從純化或標記靶蛋白開始，在空間鄰近親和純化、鄰近生物素化（BioID）、GFP融合或蛋白微陣列中鑒定共純化的蛋白。“多對多”方法旨在從單個實驗中對所有PPI進行分析，用于解析配體-靶標對和抗體-抗原對。

　　上述方法也可以分為蛋白質相互作用分析和空間鄰近分析。蛋白質相互作用分析可進一步分為二元和非二元分析。雖然二元分析（如Y2H）會直接產生成對蛋白質相互作用，但非二元分析（如AP-MS和co-IP）會產生物理關聯，其中成對鑒定的每種蛋白質可能不會直接相互作用，例如多蛋白質復合物中的蛋白質。空間鄰近性分析（例如BioID）可揭示除空間上鄰近之外，可能不會形成物理相互作用或關聯的蛋白質。

　　為高通量識別二元和多元蛋白質相互作用，加州大學圣地亞哥分校鐘聲教授研究團隊開發了一種用于大規模檢測PPI的高通量“多對多”非二元分析方法PROPER-seq，可將獨特的RNA條形碼附著到每種蛋白質上，并對這些條形碼進行測序。結果顯示，PROPER-seq能夠在單個實驗中掃描10000×10000個蛋白質對，并識別二元和多重蛋白質相互作用。利用PROPER-seq方法，研究團隊構建了人類 PPI參考圖譜，包括210518個PPI，涉及8635種蛋白質，證明該方法是一種可在轉錄組水平繪制PPI圖譜的高效技術。近日，該研究成果在Molecular Cell上發表，文章題為“Revealing protein-protein interactions at the transcriptome scale by sequencing”。

　　文章發表在Molecular Cell

　　研究團隊設想將每個PPI轉換為獨特的DNA序列，然后利用DNA測序的極高通量來解碼這些PPI。為此，研究人員開發了一種改進的mRNA-display方法，命名為SMART-display，可將一個獨特的RNA條形碼附著在每個蛋白質上。通過INLISE方法，對附著在兩個相互作用的蛋白質上的一對DNA條形碼進行測序。研究團隊將結合SMART-display和INLISE的整體方法命名為PROPER-seq。

　　圖1. 結合SMART-display和INLISE的整合圖。

　　SMART-display的輸入是用戶選擇的一組細胞。SMART-display的中間產物是一個適配于mRNA-display的基因庫，其中轉錄起始、翻譯起始和嘌呤霉素連接的序列被整合到每個基因的適當位置(圖2)。SMART-display輸出的是一個mRNA-連接蛋白復合體形式的display庫。

　　圖2. 轉錄起始、翻譯起始和嘌呤霉素連接的序列位置圖。

　　INLISE是PROPER-seq關鍵的第二步，將PPIs轉換成結構為cdna1  -linking  -cdna2的嵌合序列（圖3）。INLISE的輸入是SMART-display生成的兩個display庫。每個庫包含大約30000個mRNA-蛋白復合體。其中一個文庫稱為“誘餌”文庫，通過嘌呤霉素連接序列上的生物素被固定在鏈霉親和素珠上。另一個庫稱為“獵物”庫，與誘餌庫混合可發生相互作用。去除假的相互作用后，相互作用蛋白的mRNA條形碼被連接，以cDNA1 -linking -cDNA2的形式創建一個嵌合序列，其中cDNA1和cDNA2代表兩個相互作用的蛋白。這些嵌合序列隨后被選擇并進行對端測序。

　　圖3. cdna1  -linking  -cdna2的嵌合序列圖。

　　為了繪制人類PPI網絡，研究團隊將PROPER-seq應用于人胚胎腎細胞、T淋巴細胞和內皮細胞，將構建的6個PROPER-seq庫（HEK1、HEK2、JKT1、JKT2、HUVEC1和HUVEC2）合并為一個數據集。該數據集由大約14億對reads組成，包括210518個成對的PPIs，涉及8635個蛋白質，統稱為PROPER v1.0網絡（圖4A）。其中，1,365 和2,480個PPI得到已發表的co-IP和AP-MS數據的支持，17,638個由PrePPI算法預測但未經此前實驗驗證，并與100個與人類合成致死基因對重疊。分析數據顯示，PROPER v1.0的測序reads覆蓋16305個人類蛋白編碼基因，其中8635個蛋白編碼基因參與了PROPER v1.0的PPIs。通過比較3對二元和非二元PPI，發現非二元PPIs在PROPER v1.0富集，表明PROPER v1.0同時包含二元和非二元PPIs。此外，研究團隊還使用接近連接試驗（PLA）和co-IP對未被描述過的4個PPIs進行了實驗驗證。

　　圖4. PROPER v1.0網絡圖。

　　在評估PROPER v1.0后，研究團隊測試了細胞類型特異性基因表達是否會導致每種細胞類型的PROPER-seq數據對PROPER v1.0中鑒定的PPIs的貢獻存在差異。研究人員在兩個層次上測試了這種可能性，即每個PPI和每個子網的GO富集。在單個PPIs的水平上，約33%的PROPER v1.0的PPIs主要是由于來自特定細胞類型的reads對被識別出來的 (圖6A)。在子網層面，大多數子網絡并不優先與三種特定細胞類型中的任何一種相關聯（圖6B）。以上數據表明，PROPER-seq分析對于揭示細胞類型特異性PPIs具有很強的潛力。

　　圖5. 子網絡關聯圖。

　　綜上，在單個實驗中，PROPER-seq是一種可在轉錄組水平繪制PPI網絡的高效快速的方法，可以應用于各種細胞，且不需要專門的資源或試劑，如抗體。同時，PROPER v1.0 數據庫提供了約200000個未表征的PPI，擴展了人類參考蛋白質相互作用數據。值得注意的是，PROPER v1.0為超過17000個未經實驗驗證的計算預測的PPI提供了實驗支持，表明基于結構的計算模型具有很強的預測能力。研究團隊表示，利用PROPER-seq，普通實驗室在幾周時間內就能獲得目的細胞的整個蛋白相互作用網絡，幫助發現與許多目的細胞或組織相關的PPI。