病原學檢查
發病一周內取血液，第二周以后取尿，有腦膜炎型癥狀者取腦脊液進行檢查。
1．顯微鏡檢查直接鏡檢：取抗凝血1000轉/分、離心10分鐘，除去血細胞；血漿再以10000轉/分，離心40分鐘，棄上清取沉淀物暗視野顯微鏡檢查。染色鏡檢：涂片后用Fontana鍍銀染色鏡檢。另外，還可用免疫熒光法或免疫酶染色法檢查。
2．分離培養與鑒定將血液數滴接種于柯氏（Korthoff）培養基（4.5～5ml），每份標本接種2～3管，于30℃培養5天，每隔3～5天，用暗視野顯微鏡檢查一次。如有鉤體生長，再傳代培養，用生長良好的菌液作鑒定，陰性者至少培養30～40天，仍未查到才能報告。尿液標本一般需濃縮（離心）后培養，培養時需加抑菌劑如5-氟尿嘧啶等；也可將標本接種于豚鼠腹腔進行分離。
血清學試驗
一般在病初及發病2～3周各采血一次進行下列試驗。
1．顯微鏡凝集試驗
是常用的方法，用標準株或當地常見菌侏作抗原，分別與病人不同稀釋度的血清混合，在37℃作用2小時，然后滴片作暗視野顯微檢查。若待檢血清中有某型抗體存在，則在同型抗原孔中可見鉤體凝集成團，形如小蜘蛛，一般病人凝集效價在1：400以上或晚期血清比早期血清效價高4倍以上有診斷意義。
2．間接凝集試驗將鉤體屬特異性抗原吸附于載體上成為具有鉤體屬特異性的顆粒抗原，常用的載體有綿羊紅細胞、活性炭、乳膠顆粒等，這些抗原致敏的顆粒在玻片上與病人血清中相應的抗體作用，可出現肉眼可見的凝集。此法敏感性差，但快速簡便，尤其是炭凝集及乳膠凝集試驗，適于基層醫療單位作鉤體病的輔助診斷。
另外，補體結合試驗、間接免疫熒光試驗、ELISA等血清學方法亦可用于診斷。