| 實驗步驟 |
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
（1）退火緩沖液，2X: 1.2mol/LNaCl12 mmol/LTris-HCl、pH7.5 和 14 mmol/LMgCl2。高壓滅菌，室溫保存。
（2）B&W(結合洗脫）緩沖液：10mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA和2.0mol/LNaCl。高壓滅菌，室溫保存。
（3）dNTP溶液（含4種dNTP，每種10 mmol/L)。
（4）甲酰胺染液：0.2 ml右旋糖酐（50 mg/ml) 加0.8ml甲酰胺配成1ml染液，每份樣品用 1.5ul染液。
（5）羥胺。在通風櫥中按如下步驟準備羥胺溶液。
在玻璃管中用
1.6 ml水溶解1.39 g固體羥胺，熱水中輕搖。逐滴加入lml二乙胺, 緩慢加入750ul羥胺調節pH到6左右。為準確測定pH, 加
2滴羥胺溶液到2 ml水中。注意不要直接將電極放到未稀釋的羥胺溶液中。溶液在4°C可保存7?10天，一20°C可儲存6個月。
（6）KMnO4/TEAC，在3mol/LTEAC(氯化四乙銨）中溶解100 mmol/LKMnO4
(方法A中選用）。
（7）哌啶，10%。
2. 酶和酶緩沖液
Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶緩沖液，10X(與酶一起提供）
3. 核酸和寡核苷酸
待測和對照基因組DNA
4. 特殊設備
與篩選管或微孔滴定板系統相配套的磁力架
聚乙烯或聚丙稀材料的微孔滴定板或微管（如AdvancedTechnologies或Nunc)
聚碳酸酯不能耐受碾啶。
振蕩器，室溫下使用
鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠（DynabeadsM-280Norway)
熱循環儀
二、方法A: 放射標記反應
以下是制備放射性標記探針的方案。用p53腫瘤抑制基因中的5號外顯子作為靶DNA。
擴增待測 DNA使用同樣的步驟（不含[a-32P]dCTP)。
(一）附加材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
甲酰胺染液
H3PO4(1mol/L)
四氧化鋨*(Sigma-Aldrich)緩沖液，按下面配備。
100 mmol/LTris-HCl、pH7.7，10mmol/LEDTA,15% 嘧啶。通風櫥中，先在玻璃瓶中加入12.5 ml滅菌雙蒸水（ddH20), 然后打碎一管0.5 g的四氧化鋨，再將瓶子放到帶有鏢絲旋蓋的容器中，確保蓋子緊閉。四氧化鋨在塑料中不活潑。纏繞鋁箔后在4°C下溶解2~3天，4°C儲存。使用前用ddH20按1:5稀釋即可。四氧化鋨溶液可在-20°C儲存6個月。當與嘧啶反應時出現黃色說明反應成功，若儲存液(通常2個月后）呈現綠色或灰色，則應重新配制。
四氧化鋨溶液（在H20中1:5)
2. 核酸和寡核苷酸
5A: 5‘-TTCAACTCTGTCTCCTTCCTCTTCC-3’
5B：5‘-CTGGGGACCCTGGGCAACC-3’
在一套引物中，正義引物用生物素標記；另一套引物中，反義引物用生物素標記。
3. 放射性混合物
[a-32P]dCTP(50uCi)(1Ci=3.7X1010Bq)
4. 特殊設備
Geiger計數器
溫育或水浴，預置 37°C、42°C、90°C
磁力架，預冷
5. 附加物品
常用聚丙烯酰胺凝膠電泳設備及試劑（測序膠）
瓊脂糖凝膠電泳設備及試劑，溴化乙錠
Qiaquickspincolumns或類似設備，用來從球脂糖凝膠中純化DNA
四氧化鋨可用溶有100 mml/L高錳酸鉀（KMn04)的3mol/LTEAC(氯化四乙銨）溶液替換。高錳
酸鉀溶液應現配現用。3mol/L的TEAC在-4°C下可儲存3個月。
(二）方法
1. 均一標記探針的制備
（1）取一無菌離心管置于冰上，加入如下組分。
基因組DNA 50~100ng
引物5A 20pmol
引物5B 20pmol
dNTP溶液（10mmol/L)2.5ul
[a-32P]dCTP(25uCi/ul)2ul
Taq聚合酶（1U/ul) 1ul
PCR緩沖液（10X) 10ul
H20 至100/ul
（2）按下面程序擴增。
（3）用 20 g/L的瓊脂糖凝膠分離產物。切下目標條帶，按操作手冊用Qiaquickspincolumns純化DNA。
（4）用無菌水稀釋探針至10000cpm/ul。
如果DNA 片段未能有效地標記上，則不加同位素重新擴增. 如果凝膠顯示反應產物條帶較好，則加入同位素，用 2ul產物作為模板重復擴增。
2. 固相化學切割：形成異源分子
（5）在無菌離心管中按下面步驟進行退火反應。
探針DNA(10000cpm/ul) 5ul
待測DNA 5ul
退火緩沖液，2X 10ul
100°C 保溫 5 min，42°Clh。
（6）短暫離心收集樣品，加入 20u1磁珠（按操作手冊預洗）到每個退火反應中。
（7）室溫下輕搖（使磁珠保持懸浮）15?30 min，時間取決于 DNA 片段的大小。
（8）將管放置到磁力架上 30s。保持離心管在架子上，移去上清液。用Geiger計數器檢測沉淀以確保大部分放射標記仍吸附在磁珠上。上清液中也可能有一小部分未結合的放射性DNA片段。
（9）移去離心管，用 1體積的2XB&W 緩沖液洗一次。
（10）將管放到磁力架上，移去B&W 緩沖液。
（11）用26ulH20懸浮磁珠。
3. 化學切割反應
（12）每步退火反應產物均分到4 個新管中，每管6ul;2管用羥胺處理，另外2管用四氧化鋨處理。
當分析一條片段時，第一次（樣品通常會分析幾次）推薦將退火反應產物分到4個管中，2管用羥胺處理，另外2管用四氧化鋨處理。樣品f要用化學藥品處理不同時間（見(13)和(14)
步）。處理時間受突變類型和DNA片段大小的彩響，特別是四氧化鋨還有修飾錯配胸脒嘧啶外堿基的特性，所以一旦反應最適的保溫時間確定下來后，毎次化學處理就可以使用單個樣品。
（13）向2個羥胺反應管中分別加入20ul 羥胺溶液，37°C下一管保溫10 min，另一管保溫 30 min。
（14）向每個四氧化鋨反應管中分別加入2.5ul四氧化鋨緩沖液和15ul四氧化鋨溶液（在H20中1:5),37°C下一管保溫1min, 另一管保溫 5 min。
（15）將管子放到磁力架上 30s，保持管子在架子上，移去上清液。用Geiger計數器檢測上清液，所有成分應在沉淀中。
（16）從磁力架上移走管子，用20ul2XB&W緩沖液洗磁珠。
（17）再將管子放到磁鐵上，移去上清液。
（18）用 50ul10% 的哌啶溶液懸浮磁珠，90°C 保溫 30 min。
哌啶切割可能使鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠與DNA分離。這些磁珠需要在步中替換。
（19）冰上反應2~3 min。
（20）向每個反應混合物中加入25ul1mol/LH3P04 和10XTaqDNA聚合酶緩沖液。
混勻后于100°C 保溫5 min，緩慢冷卻到30°C(約30 min)。
（21）向每個樣品中加入 5ul 新的、預洗過的磁珠，室溫下輕搖 15?30 min。
（22）將管子放到磁力架上30s，保持管子在架子上，移去上清液。
提示：用Geiger計數器檢測放射標記的 DNA片段仍結合在磁珠上。
（23）從磁力架上移走管子，用20ul2XB&W緩沖液洗磁珠。
（24）用5ul 甲酰胺染液懸浮磁珠，90°C 保溫3 min管子放到冰上預冷的磁力架上，將上清液點樣到標準的聚丙烯酰胺測序膠。電泳結束后，曝光到X射線膠片上。
三、方法B: 熒光標記反應
如前所述，要準確定位突變位點，每個反應需要使用完全相同的引物對。熒光分析中要合成兩套完全相同的PCR引物：在第一對引物中，兩條引物都用生物素標記；而另一對引物中，每條引物用不同的熒光基團標記。簡要的技術方案如圖20-2所示。
這里提供的方案是利用鼠β-球蛋白啟動子為分析對象進行的實驗（Youiletal.1996)，引物用生物素或HEX和6-FAM標記。引物對可擴增出一條長547bp的片段（Youil etal.1996;Lambrinakosetal.1999)。
(一）附加材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,lmmol/LEDTA、pH8.0)
KMn04/TEAC溶液（lmmol/LKMnO4，3mol/LTEAC)
糖原（20 mg/ml)
乙酸納，0.6mol/L，pH5.2
乙醇, 冰上預冷
乙醇，70%
2. 核酸和寡核苷酸
兩套寡核苷酸引物：5'-GCACGCGCTGGACGCGCAT
5'-AGGTGCCCTTGAGGCTGTCC
一對引物用生物素標記；另一對引物用熒光基團標記，如HEX和6-FAM。
3. 特殊設備
ABI377、310、3100或3700DNA測序儀
干冰（可選用，見（二）方法中(16)）
溫育或水浴，預置65°C和100°C
(二）方法
1. 熒光標記探針和待測DNA的制備
（1）取一無菌離心管置于冰上，加入如下組分。
基因組DNA 50~100ng
引物5A* 20pmol
引物5B* 20pmol
dNTP溶液（10 mmol/L) 2.5ul
T叫聚合酶（lU/ul) 1ul
PCR緩沖液（10X) 10ul
H2O 至100ul
*第一套 PCR擴增中，用熒光標記引物擴增待測DNA(見材料列表>, 用生物素末端標記的引物擴增野生型 DNA。第二套PCR 中，交換標記引物對，也就是用生物素末端標記引物擴增待測DNA, 用熒光標記引物擴增野生型 DNA。
按下面 PCR 程序擴增。
（2）取少量 PCR 產物用2% 的瓊脂糖凝肢檢測。若結果令人滿意，則按如下程序進行異源雙鏈退火反應（注意：40u1 樣品足夠進行 KMn04和羥胺處理）。
野生型擴增子（20ng/ul) 5ul
待測擴增子（20ng/ul) 5ul
退火緩沖液，2X 20ul
H2O 至 40ul
100°C 保溫5 min,42°C 保溫 lh。
（3）對照組，按如下程序進行同源雙鏈退火反應。
野生型擴增子（生物素標記引物）（20ng/ul) 5ul
野生型擴增子（熒光標記引物）（20ng/ul ) 5ul
退火緩沖液，2X 20ul
H2O 至 40ul
100°C 保溫5 min,65°C保溫 80 min 緩慢冷卻至室溫（過夜）。短暫離心收集樣品后，對照組同源雙鏈分子的處理方法與異源雙鏈分子處理方法相同。
（4）按操作手冊預洗鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠，用 124B&W緩沖液重懸。
12ul 磁珠需要用12ulB&W緩沖液洗 3 次。
（5）每個退火反應（同源雙鏈分子和異源雙鏈分子）中加 6ul 磁珠懸浮液。室溫輕搖15~30 min(取決于DNA片段的大小），保持磁珠懸浮。
（6）將管子放到磁力架上30s，保持管子在架子上，除去上清液。
（7）從磁力架上移走管子，用20ulTE 洗液洗磁珠。再將管子放到架子上，除去 TE洗液。
（8）每份雙鏈樣品用12ulTE 溶液重新懸浮。
（9）每份樣品（同源雙鏈分子和異源雙鏈分子）都均分成兩份，每份 6m1。
2. 化學切割
（10）取一份同源雙鏈分子樣品及一份異源雙鏈分子樣品進行 KMn04 反應，在磁力架上除去 TE 緩沖液。在這一步中，每個反應中應有約 75~100ng 結合在磁珠上的DNA,
（11）向每個反應混合物中加20ul1 mmol/LKMnO4/3mol/LTEAC，25°C保溫 45 min。
（12）同時，分別向余下的另一份同源雙鏈分子與異源雙鏈分子樣品中加入20ul羥胺溶液(4.2mol/L)，37°C保溫30 min。
（13）將管子放到磁力架上停止反應，除去上清液。
（14）用50ulTE 洗磁珠 2 次。
（15）所有 4個管子中都加 50ul10% 哌啶溶液，90°C保溫30 min。
（16）管子放置到冰上，加入 0.5ul 糖原（20 mg/ml)、50ul 乙酸鈉（0.6mol/L，pH5.2)和 300ul 冰冷的乙酵，沉淀 DNA。-20°C 放置30~45 min 或干冰上 10min*。
（17）小離心機中 4°C 最高速離心 30 min，除去上清液。
（18）180ul70% 乙醇洗滌沉淀。
（19）小離心機中最高速離心1min, 小心除去乙醇。
（20）用1.5ul 甲酰胺染液溶解沉淀，上樣到 ABI-377DNA 序列儀（PerkinElmer)，或者加12ul甲酰胺與分子量標準后，上樣到毛細管電泳系統中。DNA片段可被熒光檢測系統檢測到。
*（16）~（19）步中沉淀 DNA 也可采用下面方法：每份樣品中加入5ul新的預洗的磁珠，室溫下輕搖15~30 min。將管子放到磁力架上30s, 保持管子在架子上，移去上清液，繼續笫 (20)步。
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