長讀長讀序列

原文地址：http://news.sciencenet.cn/htmlnews/2021/3/454746.shtm

 趙方慶（左二）與團隊成員（左一侯玲玲、右二張金陽、右一左振強）查看測序數據情況。課題組供圖

實際上，核糖核酸（RNA）不總是“一條線”，這種遺傳信息載體也會圈成一個圈。

而環形RNA是一類非常特殊的RNA分子。大量研究表明，它在腫瘤發生和天然免疫過程等過程中發揮著重要的調控作用，但人們一直缺乏對其進行有效測定的研究手段。

近日，中國科學院北京生命科學研究院趙方慶團隊提出了基于三代納米孔測序技術對環形RNA全長直接測定的實驗和分析流程——CIRI-long。相關論文刊登于《自然—生物技術》。

研究人員利用隨機引物對環形RNA進行的滾環反轉錄擴增后，使用納米孔測序技術對環形RNA的全長序列進行直接測序，并實現了對長測序讀段中的環形RNA序列進行識別和全長重構。

中國科學院上海營養與健康研究所研究員楊力和博士馬旭凱認為，該研究為深入探索復雜的環形RNA生成加工奠定了基礎。

獲得整張圖的全貌

環形RNA廣泛存在于真核生物中。目前研究表明，在生物體內，環形RNA主要通過其序列特征，發揮miRNA海綿、RBP海綿以及翻譯短肽等重要的生物學功能。

由于具有首尾相連的環形結構，環形RNA在細胞中結構更穩定，也存在更強的積累效應。因此，科學家可以利用人工設計的環形RNA分子，在細胞中穩定表達目標蛋白。同時，環形RNA在腫瘤生物標記物和作為治療靶點等多個方面都具有重要的應用前景。

但因為環形RNA序列本身和普通線性RNA高度相似，常用的二代轉錄組測序技術，往往難以獲得完整的環形RNA全長序列。

此前，趙方慶團隊的研究方向之一就是利用高通量測序技術對環形RNA進行識別。

“通過多年研究，我們深切體會到了傳統二代測序技術對于環形RNA研究的局限性。”趙方慶告訴《中國科學報》。

隨著近年來新一代測序技術的發展，基于納米孔的長讀長測序技術已經在很多領域得到廣泛應用，這種測序方法可以一次測定非常長的序列。因此研究人員想到，是否也可以使用該技術，研究環形RNA分子的結構。

“從測序數據中區分環形RNA和線性RNA的過程，類似于同時拼兩幅只有幾塊不一樣的拼圖。”論文第一作者張金陽告訴《中國科學報》，“由于兩者很相似，只有接頭位點具有特異性結構，因此利用短讀長測序技術，很難區別這些‘小塊’源于線性還是環形分子，利用長讀長技術則可以一次獲得整張圖的全貌，因此可以簡便地實現對環形RNA序列的直接鑒定。”

效率提高20倍

研究人員通過大量實驗，優化了環形RNA的富集方法，利用滾環反轉錄的方式，獲得了含有多個環形RNA全長序列的cDNA片段。他們利用超長讀長技術，對環形RNA的全長序列進行了直接測定。

研究人員還開發了相應的計算軟件，用于在測序數據中對環形RNA的全長序列進行識別和錯誤校正。

通過比較，研究人員發現，改進后的方法可以有效富集環形RNA序列，對環形RNA的檢測效率提升了近20倍。同時，CIRI-long大幅增強了環形RNA的識別能力，對長度較長的環形RNA也可以進行有效識別。

趙方慶提到，評估顯示CIRI-long可靠性高，且可以識別到來自線粒體基因組以及轉錄本通讀事件的環形RNA分子，并可實現與二代測序相近的分析成本。

近期多個研究也發現，線粒體中可以產生大量的環形RNA分子，并且可能具有調節線粒體活性氧輸出的重要功能。因此科學家利用CIRI-long方法，可以有效識別這類特殊的環形RNA分子，并為其存在提供進一步證據。

隨后，研究人員利用新方法對小鼠大腦組織中的環形RNA進行了深入研究，并發現了一類新型的環形RNA分子。這類分子由內含子的全長序列首尾相接組成，具有特殊的剪接信號，可能代表著一種未發現的環形RNA產生途徑。

線性、環形RNA有待“一網打盡”

總的來說，該方法建立了針對環形RNA全長的高效識別手段，為環形RNA的功能挖掘提供了重要的研究平臺和工具。利用該方法，研究人員可以對環形RNA的全長進行大規模測定，并基于全長序列進行功能預測，也為設計環形RNA治療靶點提供了重要的研究工具。

復旦大學的張朝以及美國得克薩斯農工大學的韓冷認為，研究結果突出了該方法在鑒定環形RNA和探索環形RNA形成機制等方面的重要意義。值得注意的是，費城兒童醫院的邢毅團隊近期開發的isoCirc也實現了基于三代測序對環形RNA全長的高效重構。這些方法提升了環形RNA的檢測效率，并能有效地重構環形RNA的全長結構，為后續研究環形RNA的功能機制及轉化應用等方面打下了堅實的基礎。

不過，CIRI-long方法仍具有一定局限性。由于環形RNA在生物體內含量很低，在目前研究過程中，研究人員采用了多步實驗手段針對環形RNA進行了富集。因此，該方法只能實現對環形RNA的高靈敏度檢測，無法同時開展對線性RNA和環形RNA的同時研究。因此，未來仍然需要對環形RNA測序進一步改進。

接下來，趙方慶團隊將繼續研究長讀長測序技術在環形RNA研究中的應用，結合實驗技術與計算方法，對環形RNA的生物學功能和應用進行深入挖掘。