間接原位PCR（原位雜交PCR）
| 實驗材料 | 組織或細胞樣品 |
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| 試劑、試劑盒 | SSC 硫酸葡聚糖 甲酰胺 脫脂奶粉 Denhardt’s 液 SDS 變性的鮭魚精DNA Rnase DTT 乙醇 |
| 儀器、耗材 | 玻片 石蠟膜 橡皮泥 濕盒 |
| 實驗步驟 |
一、預雜交 1. 試劑與配制 2×SSC 50%去離子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v） 預雜交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脫脂奶粉 2. 操作方法 （1）在進行完原位PCR擴增后，用2×SSC預浸經乙醇脫水、空氣干燥的玻片，并簡洗15 min； （2） 用50%去離子甲酰胺37℃孵育15 min； （3）加預雜交液20 μl/片，在雜交溫度下孵育30 min～2 h。 二、雜交 1. 試劑與配制 雜交液：50%去離子甲酰胺，5×SSC，10%硫酸葡聚糖，5×Denhardt’s 液，2%SDS，10 mg/ml變性的鮭魚精DNA 2. 操作方法 （1）棄預雜交液，加雜交液（含0.2～5 μg/ml探針）10～20 μl/片，覆蓋經硅化的蓋玻片，石蠟膜封片或橡皮泥封片； （2）玻片置于濕盒中，42℃雜交12～18 h（過夜，但不能超過24 h）。
三、雜交后處理 1. 試劑與配制 2×SSC Rnase（20 μg/ml） 50%去離子甲酰胺 10 mmol/L DTT 2. 操作方法 1. 雜交完畢，用2×SSC浸泡玻片數分鐘，輕輕移去蓋玻片，再用2×SSC洗玻片1～2 min； 2. 2×SSC（含20μg/ml RNase，適宜RNA探針，DNA探針可省略此步）中洗片30 min，37℃； 3. 2×SSC/50%去離子甲酰胺，42℃×10 min； 4. 1×SSC/50%去離子甲酰胺，37℃×30 min，2次； 5. 4×SSC/10 mmol/L DTT洗1 h； 6. 0.1×SSC洗2次，每次37℃×30 min； 7. PBS中洗10 min，即可進行顯色，方法同上。
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| 注意事項 |
1. 如果檢測mRNA，雙鏈探針應變性處理，方法是95～100℃加熱10 min后迅速置于冰中驟冷； 2. 以單鏈探針檢測DNA時，DNA也需變性處理，將玻片置于70～80℃變性液（70%去離子甲酰胺，即甲酰胺/2×SSC，v/v）中10 min； 3. 用雙鏈探針檢測DNA時，可按上述方法變性處理。
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