間接炭凝集試驗

實驗概要

本文以馬副傷寒性流產為例介紹了間接炭凝集試驗(indirect carbonal agglutination test)的原理及操作流程。

實驗原理

該血清反應是以炭粉顆粒為載體，將已知的馬副傷寒性流產血清吸附在該載體表面上，形成抗體炭粉結合物，即為診斷馬副傷寒性流產用的炭粉致敏血清。炭粉致敏血清與相應抗原相遇時，在電解質的參與下，二者發生特異結合，便形成肉眼可見的炭微粒凝集塊，液體變得清朗，即為陽性反應。如果二者不結合，炭粉則堆積于液滴中央，成為一個搖而不散的黑炭團，即為陰性反應。

主要試劑

1. 炭粉：炭粉的粒度最好在0.015～0.125mm的范圍內，如達不到這個標準，用前需做預處理，常用的方法是離心法。即取30g炭粉放入大離心管中，加蒸餾水100ml，邊搖邊研磨，直至均勻的分散開為止，然后以300 r/min離心3～5min，棄去沉下的粗炭粉，取含細炭粉的上液以3 000 r/min離心30min，去上清液，沉于離心管底的沉淀物，即為供致敏用的濕炭粉。此外，也可用過篩法處理炭粉，即將木炭粉置乳缽中研磨后，再用300目的標準篩過篩，收集篩后的炭粉備用，用此法篩選的炭粉顆粒較大，適合于以塑料盤做反應時應用。

2. 馬副傷寒性流產高免血清，pH值6.4 PBS，被檢抗原等。

實驗步驟

1. 致敏炭血清的制備：取濕炭粉0.25g，加1∶400稀釋的馬副傷寒性流產高免血清(以馬流產沙門氏菌制備H抗原，免疫家兔制成，效價不低于1∶5 600，56℃ 30min處理，用前用pH值6.4 PBS稀釋)3ml，混勻后，于37℃水浴中致敏60min，其間不斷振搖，取出后，以3 000 r/min離心10min，去上清液，向沉淀物中加入pH值6.4 PBS 5ml，以3 000 r/min離心10min，去上清液，按同樣的方法洗一次后，再往沉淀物中加1%兔血清(56℃ 30min滅活)、1%硼酸pH值6.4 PBS 5ml，混勻，以3 000 r/min離心10min，去上清液，最后向沉淀物中加入1%兔血清、1%硼酸pH值6.4 PBS 3ml及1%硫柳汞溶液0.03ml，充分混勻后，即為診斷馬副傷寒流產用炭血清。

對照用炭正常血清的制備，系以56℃ 30min滅活的正常家兔血清代替馬副傷寒性流產高免血清，按上述方法制備。

2. 操作方法：取20×40cm玻璃板一塊，用1ml吸管往玻璃板上依次滴加不同稀釋度的馬流產沙門氏菌肉湯培養物0.1ml，對照用溶液0.1ml。再用另一支1ml吸管往每一滴菌液中及對照的液滴中滴加免疫炭血清及正常炭血清0.05ml，用小木棒充分攪拌，在1～5min內按以下標準判定結果。

注意事項

1. 炭粉粒的大小對試驗影響較大，使用的炭粉不符合標準時，應作預處理。

2. 使用的免疫血清效價要高，低時，使用前的稀釋倍數也應相應地降低。